抗结核治疗对结核性胸膜炎巨噬细胞的作用及机制

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1、前言巨噬细胞是机体产生抗结核杆菌防御反应的第一道防线，又可作为结核菌在宿主体内长期寄生的场所，巨噬细胞的双重性决定其在结核病的发生、发展及转归中产生复杂而重要的作用。目前对临床抗结核药物的抗菌作用及机制研究已很深入及明确，但针对抗结核药如何影响机体免疫系统，尤其对巨噬细胞的影响仍不完全清楚。有限的研究仅停留在以动物模型及人体外周血为观察对象的间接证据上，缺少针对人体结核病灶微环境进行的系统阐述。鉴于此，本研究以临床结核性胸膜炎患者胸腔积液为研究对象，观察标准抗结核治疗对胸腔积液中胸膜巨噬细胞产生的影响，进而探讨药物通过机体免疫反应发挥抗结核作用及机制。本研究首先筛选新发结核性胸膜炎病例，

2、获得从未经过抗结核治疗的胸腔积液样本，以及经过标准四联药物：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇治疗3-10天胸腔积液的治疗前后的配对样本。通过检测胸膜巨噬细胞表型及功能的改变，明确药物作用对其产生的影响；采用全基因组深度测序技术，在基因水平阐明巨噬细胞上述变化的分子机制。为进一步证明抗结核药物对胸膜巨噬细胞的变化是直接作用，而非机体自身免疫系统的调节或受微环境中结核菌的刺激，遂采用体外药物单用及联合应用处理巨噬细胞的方式，观察胸膜巨噬细胞表型及基因表达的改变。结果表明，经标准抗结核治疗的患者，巨噬细胞所在胸腔积液微环境中重要的促炎因子IFNγ及TNFα与抗炎因子IL-10同步降低；胸膜巨

3、噬细胞表面特异性标志物表达增高，且巨噬细胞的吞噬功能增强；同时，在全基因组范围内有230个基因表I达呈现2倍水平改变，其中，差异表达基因主要参与了免疫防御反应、细胞增殖及迁移调节、创伤修复、细胞因子活化等作用。抗结核药物对胸膜巨噬细胞的直接作用不尽相同。其中，以吡嗪酰胺的作用最为显著，可增加巨噬细胞表面CD80及CD86表达；通过上调CHI3L1及FNBP1LmRNA表达，增强巨噬细胞对结核菌的吞噬及自噬能力，刺激巨噬细胞分泌CCL18促损伤胸膜组织修复。药物的联合应用可使巨噬细胞转化为类似具有M1型与M2型双重特征的免疫调节型细胞，在结核病的治疗中发挥重要作用。通过对临床结核病原位病灶

4、微环境中胸膜巨噬细胞的研究，发现药物作用下的巨噬细胞功能对结核性胸膜炎的治疗及转归均产生重要影响。如能充分开发巨噬细胞的上述特性，对结核病的治疗或治愈均具有重要临床意义及价值。II中文摘要抗结核治疗对结核性胸膜炎巨噬细胞的作用及机制目的：结核性胸膜炎在肺外结核病中占有很大比例，在其所处的免疫微环境可观察到典型的由巨噬细胞诱导的迟发型超敏反应。巨噬细胞在机体抗结核分枝杆菌感染的免疫反应中发挥重要作用，它是机体抗结核杆菌感染的首要防线，同时亦是结核菌在宿主体内长期寄生的场所。巨噬细胞的功能状态与结核病的发生、发展及转归密切相关。目前，临床仍采用标准四联疗法治疗结核病，对药物的抗菌作用及机制研

5、究已很深入及明确，然而药物对免疫细胞尤其对巨噬细胞的功能是否存在调节，目前研究并不深入。有限的研究仅停留在以动物实验、人巨噬细胞的体外实验、以及人外周血为观察对象的间接证据上，缺少针对人体结核病灶微环境进行的系统阐述。鉴于此，本研究拟通过对结核性胸膜炎患者经抗结核治疗后胸膜巨噬细胞表型、功能与基因型的检测，以及体外药物对胸膜巨噬细胞的直接刺激，观察胸膜巨噬细胞的上述变化，探讨四种抗结核药物对巨噬细胞产生的直接作用及调节机制，进而阐明巨噬细胞在结核病治疗中发挥的作用及机制，如能明确其作用靶点，可为结核性胸膜炎的治疗及转归提供重要的理论依据，对结核病化疗方案的调整、预后分析以及抗结核药物研发

6、等方面均具有重要临床意义及价值。方法：流式细胞术检测胸膜巨噬细胞百分率的变化与其表面标志物的表达，以及胸膜巨噬细胞的吞噬功能；ELISA法检测抗结核治疗后胸III腔积液中细胞因子的变化；对抗结核治疗前后的标本中的纯化巨噬细胞进行深度测序，qPCR对其进行验证；采用qPCR方法检测IS6110基因，对胸腔积液中结核菌进行绝对定量分析；抗结核药物单药及联合体外刺激纯化的巨噬细胞，流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物表达，qPCR方法检测基因表达水平。结果：在体：1经抗结核药物治疗后，患者胸膜巨噬细胞表面标志物CD14、CD80、CD163及CD206荧光强度明显升高（MFI：p=0.045，p=

7、0.026，p=0.016，p=0.005），后三种因子阳性细胞百分率亦增高(Percentage：p=0.041，p=0.006，p=0.003）;群体水平即非配对样本分析,与上述结果一致（MFI：p=0.017，p=0.0001，p<0.0001，p=0.0001;Percentage：p=0.002，p<0.0001，p=0.0003），CD86荧光强度升高（MFI：p=0.004）。2T细胞亚群CD3+CD4+及CD3+CD