基于高通量技术的高效秸秆类纤维素降解菌筛选及应用

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1、分类号：单位代码：10140密级：公开或（保密2～20年）学号：4031541995专业学位论文中文题目：基于高通量技术的高效秸秆类纤维素降解菌筛选及应用英文题目：ScreeningandApplicationofHigh-efficiencyStrawCellulolyticBacteriaBasedonHigh-throughputTechnology论文作者：汤晓晓指导教师：冯玉杰教授专业：环境工程完成时间：二○一八年四月基于高通量技术的高效秸秆类纤维素降解菌筛选及应用汤晓晓辽宁大学辽宁大学硕士专业学

2、位论文基于高通量技术的高效秸秆类纤维素降解菌筛选及应用ScreeningandApplicationofHigh-efficiencyStrawCellulolyticBacteriaBasedonHigh-throughputTechnology作者：汤晓晓指导教师：冯玉杰教授专业：环境工程专业方向：生物质能源答辩日期：2018年5月25日二〇一八年五月·中国沈阳辽宁大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注的内容外，不包含其他个人或

3、集体已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中进行了标注，并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权辽宁大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时

4、授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国博士学位论文全文数据库》和《中国优秀硕士学位论文全文数据库》并通过网络向社会公众提供信息服务。学校须按照授权对学位论文进行管理，不得超越授权对学位论文进行任意处理。保密（），在年后解密适用本授权书。（保密：请在括号内划“√”）授权人签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要摘要纤维素类生物质资源是自然界中最丰富的可再生资源之一，纤维素资源的开发利用对于解决当前环境污染、能源危机和粮食短缺等世界性难题具有重要的意义。为进一步增加纤维素生物质的分

5、解效率，获得更多的纤维素降解菌资源，因此，开展了纤维素降解菌筛选的研究。本研究首先建立了高通量纤维素降解菌的筛选方法。基于传统的纤维素降解菌筛选原理,以24孔板和96孔板作为载体减小体系和增加筛选通量，结合刚果红培养基的鉴别作用，以及酶标仪批量采集数据的功能，建立了一套微量、灵敏、快速的高通量筛选方法，并对该方法的培养体系及检测体系进行了优化。结果发现，当24孔深孔板的装液量为2.5mL，培养时间为48h时，微生物的生长效果最好。当酶标仪的检测波长为500nm，96孔板中DNS添加量为120µL时，检测体系

6、的准确性最佳。基于本研究建立的高通量筛选方法，从牛粪中初筛得到9株纤维素降解菌。24孔板发酵复筛后，选取纤维素酶高产菌C-7进一步研究。菌株C-7为革兰氏阳性短杆菌，大小约为1.5～2μm×0.5μm。初步鉴定为Aneurinibacillussp.strainN8。对其产酶条件进行优化。在初始pH为9，55°C摇瓶培养120h时能够表现出最大的产酶活性，此时CMCase活力和FPase活力分别为1.68U/mL和0.91U/mL。以土壤、牛粪、牛瘤胃液作为筛选源，在厌氧条件下，经长期富集、驯化培养获得具有

7、高效降解纤维素功能的复合菌系H1。该复合菌系5天滤纸纤维素降解率可达89%，在不同培养代数、不同接种量和不同浓度底物培养时均能对滤纸纤维素保持较高的降解量。对玉米秸秆、水稻秸秆的降解率最高可达61.5%和56.4%。H1的发酵的产物主要为丁酸和乙酸，且发酵过程中可以产生一定量的H2。分别以0.5%的滤纸、玉米秸秆和水稻秸秆为底物发酵7天，乙酸的产量分别为1566mg/L、923mg/L和740mg/L左右。丁酸的产量分别为2600mg/L、1323mg/L和986mg/L左右。H2积累量分别为32ml、9.

8、6mL和5mL左右，约占总产气量的23%、15%和12%左右。在不断富集培养的过程中，复合菌系H1中微生种类和比例组成趋于稳定。对复合菌系进行高通量测序，发现梭菌为主要的优势菌种，主要功能为纤维素的降解及产氢，其次含有一部分杆状菌，主要作用为产酸。I摘要关键词：纤维素降解菌，复合菌系，高通量，纤维素酶IIAbstractABSTRACTCellulosebiomassresourcesareoneofthemos