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时间:2019-03-12
《pcv2体外培养特性的研究及hmgcr对pcv2复制的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、中文摘要PCV2体外培养特性的研究及HMGCR对PCV2复制的影响猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪圆环病毒病(PCVAD)呈世界性分布,是近几年影响世界养猪业最重要的病毒性传染病之一,目前本病尚无特效药物。一方面由于该病毒生长较为缓慢,在体外培养时病毒滴度较低;另一方面PCV2基因组小,编码蛋白数量少,从而限制了靶向抗病毒药物的研发。因此,研究PCV2培养特性、PCV2与宿主的相互作用,对于深入了解病毒的致病机理、寻找阻断病毒复制的方法、筛选有效的药物靶标具有非常重要的理论意义和实际应用价值。本研究从断奶仔猪多系统衰
2、竭综合征(PMWS)患病猪的肺脏中分离了一株PCV2,将其命名为PCV2CC1毒株。通过全基因组测序确定其基因分型为PCV2b型。PCV2基因组小,编码蛋白数量少,需要依赖宿主蛋白来完成其复制周期。根据PCV2的复制特点分别用D-氨基葡萄糖、NH4Cl、甲基-β-环糊精(MβCD)、艰难梭菌毒素B、刀豆蛋白A(ConA)、重组猪II型白介素(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)处理PK-15细胞系,并对PCV2的增殖效果进行比较。结果表明IL-2、ConA、D-氨基葡萄糖和MβCD可持续促进PCV2在PK-15细胞系中的
3、增殖,且D-氨基葡萄糖、ConA和甲基-β-环糊精联合处理对PCV2增殖的促进效果更为明显。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是胆固醇生物合成途径的限速酶,可参与多种病毒的感染过程,然而目前尚无HMGCR与PCV2感染相关的报道。前期实验表明,用MβCD处理宿主细胞降低细胞膜胆固醇后,可促进病毒的复制。因此,推测HMGCR对PCV2感染有影响。本研究发现,接种PCV2后PK-15细胞系中HMGCR的磷酸化水平升高,说明PCV2感染可降低细胞中HMGCR活性,因此推测HMGCR可能影响PCV2在PK-
4、15细胞系中的复制。通过转基因方法构建了稳定的HMGCR高表达细胞株PK-HMG;利用RNA干扰技术构I建了HMGCR基因沉默细胞株PK-shHMG;根据显性负性突变原理,将猪源HMGCR的S869磷酸化位点突变,构建了HMGCR显性负突变细胞株PK-S869Amutant,从而检测上述细胞株中HMGCR的表达量对PCV2复制的影响。结果表明HMGCR高表达后PCV2的复制量显著下降,而HMGCR基因沉默细胞株中的PCV2复制效果则显著增强,说明PCV2的产量与宿主细胞中HMGCR的表达量呈负相关。同时,还发现HMGC
5、R显性负突变细胞株在接种PCV2后48h时即发生明显的细胞凋亡。比较几种细胞株在接种PCV2后48h时的细胞凋亡程度和Caspase-3的活性,结果表明与对照细胞和HMGCR基因沉默细胞相比,HMGCR显性负突变细胞在PCV2感染48h时发生更为明显的细胞凋亡,且Caspase-3活性显著升高;用Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK处理HMGCR显性负突变细胞后,细胞中Caspase-3的活性显著下降,而PCV2在HMGCR显性负突变细胞中的复制则显著增强,且与Caspase-3抑制剂的浓度呈剂量依赖关系。这些结
6、果表明,HMGCR的表达量与PCV2诱导的细胞凋亡呈负相关。为进一步证实上述结果,本研究构建了PCV2感染的BALB/c小鼠动物模型,采用灌胃的方法每日定量给药,从而在体内研究了HMGCR抑制剂(阿托伐他汀)对PCV2复制的影响。结果表明,阿托伐他汀处理可促进PCV2在小鼠体内的复制,与体外研究结果相符。对肠系膜淋巴结进行免疫组化检测,结果显示,PCV2主要定位于淋巴细胞的细胞质和细胞膜。关键字:猪圆环病毒2型,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶,显性负突变,病毒复制,动物感染模型IIAbstractStudyo
7、nPropagationofPCV2invitroandtheRoleofHMGCRinPCV2ReplicationPorcinecircovirustype2(PCV2),theprimarycausativeagentofporcinecircovirus-associateddisease(PCVAD),isanemergingswinepathogencausingimmenseeconomiclossesintheglobalswineindustry.Untilpresent,therehasbeenno
8、satisfyingtreatmenttargetingthisvirus.PCV2isanextremelyslow-growingvirus,andPCV2infectionandreplicationincellcultureyieldverylowviraltiters.PCV2hasasmallgenomesizeand
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