mirna-1296 和mirna-370对奶山羊mthfr基因表达的调控作用研究

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1、分类号：S814.8学校代码：10712UDC：636.3研究生学号：201305054-密级：公开灶衣林科长大学i2015届全日制硕士专业学位研究生学位论文miRNA-1296和miRNA-370对奶山羊MT/ffT?基因表达的调控作用研究类型农业推广硕士领域、方向养殖研究生高特仰指导教师曹斌云教授完成时间2015.5中国陕西杨凌研究生学位论文的独创性声明本人声明：所呈交的全日制颂士专业学位论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反

2、此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致■谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：、^f為众时间：年〈月>5日导师指导研究生学位论文的承诺本人承诺：我的全日制硕士专业学位研究生_^7_1^^_所呈交的硕士学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技

3、大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学

4、位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：私I介了时间：年玄月巧曰时间：>〇丨t年立月巧日miRNA-1296和miRNA-3

5、70对奶山羊MTHFR基因表达的调控作用研究摘要MTHFR是一种黄素蛋白，在叶酸代谢过程中起到限速作用，而MTHFR的表达可能会影响叶酸代谢继而影响乳蛋白合成。miRNA与靶基因的结合可能会因靶基因3'UTR结合位点处的突变而发生改变，进而影响基因的表达。本课题组前期的研究结果表明，奶山羊MTHFR-3'UTR存在c.2494G>A突变。为研究MTHFR基因对乳蛋白合成作用的影响，寻找影响MTHFR基因表达的miRNA显得尤为重要。本研究利用生物信息学分析发现miRNA-1296和miRNA-370能够与野生型（2494G）MTHFR-3'UTR结合。

6、为了验证c.2494G>A突变对miRNA结合位点的影响，本研究克隆了野生型和突变型（2494A）MTHFR-3'UTR，构建野生型和突变型psiCHECK™-2-MTHFR-3′UTR双荧光素酶报告载体。通过脂质体转染法将重组载体和miRNAmimics共转染到乳腺上皮细胞中，检测双荧光素酶的相对表达量。将miRNAmimics单独转染到乳腺上皮细胞中，检测MTHFR蛋白的表达。主要研究结果如下：1、奶山羊MTHFR-3'UTR区的克隆、测序分析及重组载体的构建利用奶山羊基因组克隆出野生型（2494G）和突变型（2494A）MTHFR-3'UTR，全

7、长为314bp。构建野生型和突变型psiCHECK™-2-MTHFR-3′UTR双荧光素酶报告载体，并通过测序和双酶切法鉴定。2、奶山羊乳腺上皮细胞的培养和鉴定采集不同基因型的奶山羊乳腺组织（野生型和突变型），利用组织块贴壁法培养奶山羊乳腺上皮细胞，经过3-5次传代得到纯化的奶山羊乳腺上皮细胞，并对培养的乳腺上皮细胞进行鉴定。3、miRNA对野生型和突变型重组载体荧光素酶表达的影响将重组载体psiCHECK™-2-MTHFR-3′UTR与miR-370、miR-1296通过脂质体共转染奶山羊乳腺上皮细胞，检测荧光素酶的相对表达量。结果显示，用miRNA

8、-370与重组载体共同转染乳腺上皮细胞时，psiCHECK™-2-MTHFR-3′UTR-24