grp78参与emt促肺癌转移的分子机制及益气除痰方干预机制的研究

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1、Ｉ？．，．分类号Ｒ２７３学校代号１０５７２ＵＯＣ６１０密级公开学号２０１２２１０１０３４■■■■■■＞■—＞■Ｉ—■■■ＩＩＩ４？＇仲１广區為大旁０Ｉ中‘．‘．ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ博士学位论文‘．－．＿？’ｉ？－ＩＧＲＰ７８参与ＥＭＴ促肺癌转移的．分子机制丨及益气除痰方干预机制的研究「■．■，ｔ？‘？？．：＇？．，．心－＇＊？ｉ？ｉ‘、？，

2、＇－■气；：‘陈■学位申请人昌明指导教师姓名林丽珠专业名称中西医结合临床申请学位类型专业学位论文提交日期２０１５年４月广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期年／月日关于学位论文

3、使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检‘索。，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名？爲论文导师签名下叫日期：『年月日ｆＩ（Ｊ摘要目的：课题组前期的蛋白质组学研究发现，益气除痰方可明显下调小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌组织ＧＲＰ７８、ｖｉｍｅｎｔｉｎ的表达，而Ｖ

4、ｉｍｅｎｔｉｎ是上皮间质转化（ＥＭＴ）的关键标志物，推测益气除痰方可能通过下调ＧＲＰ７８来逆转ＥＭＴ的发生。本研究拟通过建立Ａ５４９细胞缺氧模型诱导ＧＲＰ７８高表达，构建ｓｉＲＮＡｔ干扰ＧＲＰ７８下调作对照，探讨ＧＲＰ７８ｌ向高表达诱导ＥＭＴ的作用机制。并采用蛋白特异性抑制剂分别抑制ＳＲＣ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ．ＡＫＴ、ｓｍａｄ２／３通路的激活，以探究缺氧环境下细胞发生ＥＭＴ的相关分子机制。同时釆用体ＲＰ７８Ｔ，内外双水平实验，探索益气除痰方下调Ｇ抑制ＥＭ发生的作用机制为揭示缺氧微环境下肿瘤细胞发生ＥＭＴ的分子机制及中药复方抑

5、制ＥＭＴ的作用机理提供理论和实验依据。方法：－１．细胞实验部分：以我科常用的治疗肺癌方益气除痰方为工具药，以人肺腺癌Ａ５４９细胞为紀细胞，运用细胞缺氧培养箱构建Ａ５４９细胞缺氧模型；ＡｎｎｅｘｉｎＶ／Ｐ工双染法检测细胞调亡；细胞免疫突光标记方法观察ＧＲＰ７８在细胞中的分布及表达；采用ＲＴ－ＰＣＲＥＭＴＳｎａ方法从基因水平对相关转录因子（ｉｌ１、Ｓｎａｉｌ２、Ｔｗｉｓｔ、ＺＥＢＵＺＥＢ２）ＷｂＥＭＴＥ－ｉ进行定量检测；运用ｅｓｔｅｒｎｌｏｔ从蛋白水平检测相关标记物（ｃａｄｈｅｒｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎｆｉｂｒｏｎｅｃ

6、ｔｉｎ）的表达，并检测ＧＲＰ７８，ＳＲＣ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｍａｄ２／３和等相关信号蛋白的表达及其憐酸化激活水平。构建ＧＲＰ７８质粒转染Ａ５４９细胞以沉默ＧＲＰ７８表达，结合ＳＲＣ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ．ＡＫＴ、ｓｍａｄ２／３等蛋白特异性抑制剂的干预作用，探索缺氧微环境下细胞发生ＥＭＴ的分子机制及益气除痰方逆转ＥＭＴ的作用机理。２．动物实验部分：构建裸鼠Ａ５４９肺癌移植瘤模型，造模成功后随机分为空白对照组和益气除痰方组，然后进行灌胃给药。给药期间每３天测量小鼠体重和瘤体体积。给药结束后，；观，计算转移抑制率。

7、应用，测量瘤重计算抑瘤率察肺表面转移结节ＥＭＴ－ｃａｄｈｅｒｆ免疫组化法检测瘤体组织相关标记物（Ｅｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ和ｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）的表达，并检测ＧＲＰ７８及ＳＲＣ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ．ＡＫＴ、ｓｍａｄ２／３等蛋白表达及其磷酸化的表达水平。结果：肺癌Ａ５４９细胞在缺氧环境培养时，其细胞形态出现明显变化，由扁圆梭形的上－ｃａｄｈｅｒｎ皮细胞形态变为明显拉长的纺缍形间质细胞形态。同时代表上皮表型的Ｅｉｉｆｉｂｒｏｎｅｃ蛋白表达明显下降，而代表间质表型的ｖｉｍｅｎｔｎ和ｔｉｎ蛋白表达明显升高，ＥＭＴ相关转录因子

8、（Ｓｎａｉｌｌ、Ｓｎａｉｌ２、ＺＥＢｌ、ＺＥＢ２、Ｔｗｉｓｔ）的表达也明显上升、Ｐ〈０．０５），提示在缺