酵母源金属硫蛋白排铅及对铅致氧化损伤修复作用的研究

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1、摘要金属硫蛋白（Metallothionein，简称MT）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，因其具有强抗氧化、螯合重金属离子及解除重金属毒性等生物学功能，已逐渐被应用于排铅药物、功能性食品、饲料添加剂和化妆品等领域。本课题组前期经金属诱导剂诱导酵母类微生物，获得具有自主知识产权的酵母源金属硫蛋白，较传统哺乳动物源金属硫蛋白提取周期短，获取技术便捷、成本低廉及安全性较高等优点显著，利于工业化生产和推广示范应用。本文以体外与体内作用联合评价方式对酵母源金属硫蛋白排铅及对铅致氧化损伤修复作用进行了以下四方面的研究：首先，以VC与兔肝Zn-MT为对照，通过分光光度法测定两种

2、金属硫蛋白亚型（MT-Ⅰ、MT-Ⅱ）对羟基自由基、超氧阴离子自由基及DPPH自由基清除效果及其总还原能力，以此对酵母源金属硫蛋白体外抗氧化活性进行初步评价。结果表明：在体外抗氧化活性方面，酵母源金属硫蛋白抗氧化活性强于同浓度的VC，其中MT-Ⅰ体外抗氧化活性强于MT-Ⅱ。以兔肝Zn-MT为对照，采用石墨炉原子吸收光谱法及SDS-PAGE凝胶电泳，测定两种酵母源金属硫蛋白亚型（MT-Ⅰ、MT-Ⅱ）在模拟胃肠环境中对铅离子的螯合作用。实验结果显示：模拟胃环境中，MT-Ⅰ与MT-Ⅱ对铅离子的螯合率显著高于Zn-MT，胃蛋白酶对MT-Ⅰ和Zn-MT螯合铅离子效果具有一定的减弱作用，而

3、对MT-Ⅱ影响不明显。模拟肠环境中，金属硫蛋白螯合铅离子能力关系为Zn-MT＞MT-Ⅰ＞MT-Ⅱ，胰蛋白酶较胃蛋白酶对金属硫蛋白螯合铅离子效果影响较小。结果表明：虽然模拟胃肠环境对酵母源金属硫蛋白巯基具有一定程度的破坏作用，但MT-Ⅰ与MT-Ⅱ在模拟胃肠环境中均能显著地螯合铅离子，并在12h内能较好的抵抗模拟胃肠环境的消化，保持其螯合铅离子能力。一次性腹腔注射醋酸铅构建急性铅中毒小鼠模型，以DMSA与兔肝Zn-MT为对照，连续灌胃给予酵母源金属硫蛋白14d后，测定小鼠血铅水平、MDA、SOD及GSH-Px水平，期间记录小鼠形态特征及体重变化。实验结果显示，与模型组比较，金属硫

4、蛋白及DMSA处理组小鼠血铅水平显著下降（P<0.05），且呈显著的量效关系（P<0.05），MT-Ⅰ与Zn-MT排铅效果无明显差异（P>0.05），但显著高于MT-Ⅱ（P<0.05），三种金属硫蛋白处理组小鼠血清中MDA、SOD及GSH-Px水平驱于正常（P＜0.05），其中MT-Ⅰ与MT-Ⅱ处理组小鼠血清中MDA水平显著低于Zn-MT（P<0.05），SOD与GSH-Px水平无明显差异性（P>0.05），DMSA处理组小鼠MDA水平显著高于高剂量金属硫蛋白处理组II（P<0.05）。结果表明：两种酵母源金属硫蛋白亚型对急性铅中毒小鼠具有显著排铅效果（与动物源金属硫蛋白效果

5、类似），并能显著提高抗氧化酶活性，减少脂质过氧化产物，修复铅致机体氧化损伤。以DMSA与兔肝Zn-MT为对照，醋酸铅溶液致慢性铅中毒小鼠连续灌胃给予MT35d后，测定小鼠体重、血铅、部分血常规及肝功能指标水平，观察小鼠肝肾组织病变程度。实验结果显示，与模型组比较，金属硫蛋白处理组小鼠体重无显著变化（P＞0.05）；高剂量金属硫蛋白处理组小鼠血铅含量显著下降（P＜0.05），白细胞、红细胞平均体积及血红蛋白水平显著升高（P＜0.05），但各中毒组小鼠粒细胞计数水平无显著差异性（P>0.05）；各给药组小鼠GPT水平均显著下降（P＜0.05），同时高剂量金属硫蛋白处理组小鼠GOT

6、水平均显著下降（P＜0.05），小鼠肝肾组织病变程度明显改善，其改善程度优于DMSA组。结果表明，两种酵母源金属硫蛋白亚型对慢性铅中毒小鼠均具有明显的排铅及肝肾功能保护作用，作用效果类似于动物源金属硫蛋白。关键词：金属硫蛋白；铅中毒；氧化损伤；修复IIIAbstractMetallothionein(MT)isakindofmetalbindingproteinwithlowmolecularweightthatisrichincysteineprotease.Becauseofitsstrongbiologicalfunctionssuchasanti-oxidation,

7、chelatingheavymetalionsandheavy-metaldetoxification,metallothioneinhasgraduallybeenappliedtotheareasofdeleadingdrugs,functionalfood,feedadditivesandcosmetics,etc.Inourresearchgroup’spreviouswork,wehadobtainedtheinducedmetallothioneinsfromyeastbyinducer,w