莲子心提取物对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究

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中图分类号：R587.1单位代码：13705UDC�616-03密级：公开CHENGDUMEDICALCOLLEGE硕士学位论文莲子心提取物对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究学科专业病理学与病理生理学研究方向天然药物作用机制及药代动力学研究指导教师马松涛教授学生姓名3A学号1233020026二零一五年五月 中图分类号：R587.1单位代码：13705UDC：616-03密级：公开硕士学位论文莲子心提取物对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制研究学科专业病理学与病理生理学研究方向天然药物作用机制及药代动力学研究指导教师马松涛教授学生姓名邓碧学号1233020026二零一五年五月 ChengduMedicalCollegeMasterDegreeThesisTheprotecteffectandmechanismofPlumulaNelumbinisextractonrenalofdiabeticratMajor:PathologyandpathophysiologResearchfield:MechanismandpharmacokineticresearchofnaturalmedicineAdivser:songtaoMaProfessorNameofPostgraduate:biDengPostgraduateNumber:1233020026May,2015 论文独创性声明本人郑重明：所呈交的学位朵文是我个人在导呷括导下进行研究工作所®萍的成果.尽我所知，除T文中特钊加以标注和致埘的地方外.学&论文寺不包含其他个人或里体巳经发表玟撗写过的妒究成臬>也不姐含为获热成都医学院或其它教育机均的学位或证书所使用过的材枓。与我一同工作的间志对本研究所故的任何贡K均8•在论文中作了巧确的说明并表示了讲研究生筌名I#赛節年/月曰关于论文使用授权的声明本人完全了解成抝匡学院有关保菹、使周学位论文的規定，W�学校有权IS留并向国家有关却丨1成?1构这交论文的复印件和电子扳，允许论文被奁S3和伟阅，可以呆用形印.缩印或杻描等炅刳手段保存，无垛学位论文，洞意成都垔学院可以用不同方式在不同媒体上发表，传禕学位论文的全却威邰分内容。斫宂生签名:呼%ih5^3 目录摘要................................................................IAbstract...............................................................IV第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠体内作用研究.......................11.引言..........................................................12.实验材料及方法.................................................22.1实验材料..................................................22.2实验方法..................................................42.3统计学分析...............................................123.实验结果......................................................123.1各组大鼠各时间点体重的比较...............................123.2各组大鼠血糖水平的比较...................................143.3各组大鼠尿糖水平的比较...................................143.4各组大鼠微量蛋白量的比较.................................153.5各组大鼠尿蛋白水平的比较.................................163.6各组大鼠Crea、BUN的比较................................163.7各组大鼠肾脏病理结果比较.................................173.8大鼠各处理组肾脏NADPH氧化酶活性结果...................193.9各处理组大鼠NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox表达的比较..204.讨论及结论.....................................................21第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响...................................................................241.引言..........................................................242.材料与方法....................................................262.1实验试剂及设备...........................................262.2实验方法.................................................272.3统计学分析...............................................303.实验结果......................................................303.1不同浓度的Nef、Iso对肾小球NADPH氧化酶活性的影响.......303.2原代培养的细胞形态学观察.................................333.3Nef、Iso对原代培养的细胞NADPH氧化酶活性的影响.........334.讨论及结论....................................................34参考文献.............................................................36综述.............................................................39附录.............................................................52致谢.............................................................55 成都医学院硕士学位论文摘要目的观察不同剂量的莲子心提取物对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠血糖、尿糖、尿蛋白、微量白蛋白及肾脏病理的影响，在此基础上进一步观察甲基莲心碱、异莲心碱对高糖刺激下的肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响，探讨莲子心提取物对肾脏的保护作用及可能的作用机制。方法选用清洁级、雄性SD大鼠120只，体重230-260g，适应性饲养1周，随机选取12只作为对照组（CN）用柠檬酸盐缓冲液尾静脉注射，余下108只大鼠尾静脉注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）39mg/kg，72h后尾静脉取血测定造模大鼠空腹血糖，选取血糖≥16.7mmol入选为1型糖尿病。对造模成功大鼠进行随机分组：糖尿病模型对照组、3个不同剂量的莲子心提取物干预组（剂量分别为：20,50,200mg/kg）、卡托普利组，分别于0,4,8周末收集尿液，测定尿糖、尿微量白蛋白、尿蛋白、尿肌酐等指标，8周后处死大鼠取肾脏并计算肾指数，取左侧肾组织用10%甲醛固定，进行HE染色3观察肾脏病理改变，取1mm组织固定于电镜液，电镜观察肾脏超微结构改变；右侧肾组织液氮保存，检测NADPH氧化酶活性，并用westernBlot检测NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox的表达情况。为进一步明确莲子心提取物活性成分，原代分离雄性SD大鼠肾小球后，按照不同的分组加入不同浓度的甲基莲心碱（neferine，Nef）、异莲心碱（isoliensinine，Iso）培养1、12h后，用细胞色素C法检测NADPH氧化酶活性；原代分离的肾小球培养20d，消化细胞后，按照不同的分组加入不同浓度的Nef、Iso，培养12h后，加入CM-H2DCFDA探针检测NADPH氧化酶活性。结果1.各组大鼠生化指标比较I 成都医学院硕士学位论文大鼠在给予STZ后，其体重增加减慢，与对照组比较有统计学差异。莲子心提取物各剂量组及卡托普利对DN大鼠体重无明显影响，与模型组比较无统计学意义。在静脉注射STZ39mg/kg后72小时，大鼠血糖水平显著增高，并一直维持到试验结束，与对照组比较有统计学差异（P＜0.01）；莲子心提取物各剂量组及卡托普利对DN大鼠血糖水平无明显影响，与模型组比较无统计学差异。大鼠在注射STZ后，其尿糖、尿微量白蛋白、尿蛋白升高，与对照组比较有统计学差异（P＜0.01）；莲子心提取物各剂量对DN大鼠尿糖水平无明显影响。莲子心各剂量组能降低DN大鼠尿微量白蛋白，与模型组比较有统计学差异（P＜0.01），莲子心提取物50mg/kg与模型组比较表现出较明显的降低大鼠尿微量白蛋白的作用。除此以外，莲子心提取物能显著降低DN大鼠尿蛋白（P＜0.01），4周末较8周末作用明显。2.莲子心提取物对各组大鼠肾脏病理影响结果显微镜下可见对照组大鼠肾脏结构正常。模型组11例大鼠肾标本出现程度不等的肾小管上皮空泡变性；但基底膜未见明显增厚，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；卡托普利组10例肾标本出现程度不等的肾小管上皮空泡变性，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；莲子心20mg/kg组：10例肾标本出现程度不等的肾小管上皮空泡变性；莲子心50mg/kg组：7例肾标本出现程度不等的肾小管上皮空泡变性；莲子心200mg/kg组：8例肾标本出现程度不等的肾小管上皮空泡变性。电镜结果显示，对照组肾小球基底膜结构基本正常，厚度均匀，足突结构正常，足细胞无凋亡、脱落；模型组肾小球基底膜增厚，足突增宽，足细胞减少；莲子心高、中、低剂量组均能显著降低DN大鼠肾小球基底膜厚度（p＜0.01），显著降低足突宽度（p＜0.01），使足细胞数增多，并呈一定的剂量依赖特性。3.莲子心提取物对各组大鼠肾脏NADPH氧化酶活性的影响模型组大鼠肾脏NADPH氧化酶活性明显提高，与对照组比较有明显统计学差异，莲子心提取物各干预组能降低大鼠肾脏NADPH氧化酶活性，与模型组比较，差异具有统计学意义。II 成都医学院硕士学位论文4.NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox表达结果模型组NADPH氧化酶p22phox、p67phox表达明显增加，与空白组比较有显著差异（P＜0.01)，莲子心提取物各剂量组及卡托普利能减少NADPH氧化酶亚基p22phox的表达，其中莲子心提取物各剂量组差异显著(P＜0.01)；莲子心各剂量组均能减少NADPH氧化酶p67phox的表达，与模型组比，有显著差异（P＜0.01）。5.neferine、isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响20umol的neferine能抑制HG刺激下肾小球的NADPH氧化酶活性，与HG组（模型）比较，差异具有统计学意义。5、10、40umolisoliensinine处理1h后，能减弱HG刺激的肾小球的NADPH氧化酶活性，与CN组比较，差异具有统计学意义，但作用12h后，差异没有统计学意义；用CM-H2DCFDA探针检测20umol的neferine、isoliensinine对HG处理的肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性，HG组NADPH氧化酶活性明显增强，所产生的荧光强度也最强，neferine、isoliensinine对HG处理的原代肾脏细胞NADPH氧化酶活性有抑制作用，产生的荧光较弱，其中Apocynin的抑制作用最强，产生的荧光最弱。结论1.莲子心提取物可能通过减弱肾脏NADPH氧化酶活性，减弱肾脏的氧化应激，发挥肾脏保护作用；2.莲子心提取物中主要成分甲基莲心碱、异莲心碱能减弱高糖刺激下的肾脏细胞NADPH氧化酶活性。关键词:莲子心提取物；NADPH氧化酶；甲基莲心碱；异莲心碱III 成都医学院硕士学位论文AbstractObjectiveToobservetheeffectsofdifferentdosesofPlumulaNelumbinisextractonbloodglucose,urineglucose,urineprotein,albuminandrenalpathologicalofdiabetesratsinducedbystreptozotocin(STZ).WealsoobservateNADPHoxidaseactivityofprimarycellandglomerularculturedinHG,whichpre-treatedbyLiensinine,isoliensinine.ExplorethepossiblemechanismandtheprotectiveeffectsofPlumulaNelumbinisextractonkidney.Method120maleSDrats,weighting230-260gwerebeselected.Afterfeedingfor1weeks,werandomlyselected12ratsascontrolgroupreceivedcitratebufferintraperitoneal.Type1diabeticmodelwasinducedbyinjectionofstreptozotocin(STZ)atadoseof39mg/kgontheremaining108rats.72hlater,venousbloodwerecollectedinmodelrats,fastingbloodglucose16.7mmolorgreaterwereselectedforthetype1diabetesmellitus.Thesuccessfulmodelratswererandomlydividedintofivegroups:controlgroup,diabeticmodel,4differentdosesofthePlumulaNelumbinisextractinterventiongroup(20,50,200mg/kg),theCaptoprilgroup.Glucoseinurine,urinaryalbumin,urineprotein,urinecreatinineweredetermined0,4,8weeksatthebasalrespectively.Aftertheanimalsweresacrificed,thenkidneywasremovedandcalculatedtherenalindex,theleftrenaltissuewasfixedin10%formalin,stainedwithHEtoobservethepathologicalchangesofrenaltissue,1mm3kidneytissuewasfixedonelectronfluid,electronmicroscopeobservationoftheultrastructuralchangesofkidney.TherightkidneywaspreservedinliquidnitrogentodetectetheactivityofNADPHoxidaseandexpressionofp22phox,p67phoxbyWesternBlot.MaleSDratswereseparated,weadddifferentmedicinetocultureglomerularaccordingtodifferentgroups.Afterculturedfor1,12h,CytochromeCwerebeusedtoassayNADPHoxidaseactivity.Wecultureprimaryglomerularfor20d,anddigestedcells,accordingtodifferentgroupsaddmedicine,thenculturedfor12h,NADPHIV 成都医学院硕士学位论文oxidaseactivityweredetectedbyCM-H2DCFDAprobe.Result1.ComparsionofbiochemicalindexsamongthesixgroupRatsafteradministrationofSTZ,theweight,sgainratedecreased,therewassignificantdifferencecomparedwiththecontrolgroup.PlumulaNelumbinisextractgroupandcaptoprilhadnosignificanteffectonthebodyweightofDNrats.AfterintravenousinjectionofSTZ39mg/kgfor72hours,thebloodglucoselevelsofratsincreasedsignificantly(P＜0.01),andhasbeenmaintainedtotheendofthetest.RatsAfterinjectionofSTZ,theurine,urinaryalbumin,urineproteinsignificantlyincreased（P＜0.01).PlumulaNelumbinisextracthadnosignificanteffectonurineglucoselevelsofDNrat.PlumulaNelumbinisextractcansignificantlyreduceurinemicroalbumin(P＜0.01).TheroleofPlumulaNelumbinisextractat50mg/kgismoresiginificant.Inaddition,PlumulaNelumbinisextractcansignificantlyreducetheurineproteininDNrats(P<0.01),theroleof4weekismoresignificantthan8week.2.TheinfluenceofPlumulaNelumbinisextractonrenalpathologyofDMratsWhenobserveundermicroscope,thecontrolgroupratshadnormalrenalstructure,11casesofratsrenalspecimenswerefoundrenaltubularepithelialvacuolardegeneration;butnoobviousthickeningofthebasementmembrane,andnoinflammatorycellinfiltrationandfibroustissuehypertrophyintheinterstitial.Thecaptoprilgroup10casesofratsrenalspecimenswerefoundrenaltubularepithelialvacuolardegenerationandnoinflammatorycellinfiltrationandfibroustissuehypertrophyintheinterstitial.10casesofratsrenalspecimenswerefoundrenaltubularepithelialvacuolardegenerationinPlumulaNelumbinisextract20mg/kggroup.7casesofratsrenalspecimenswerefoundrenaltubularepithelialvacuolardegenerationinPlumulaNelumbinisextract20mg/kggroup8casesofratsrenalspecimenswerefoundrenaltubularepithelialvacuolardegenerationinPlumulaNelumbinisextract20mg/kggroup.Electronmicroscopeobservation:controlgroupglomerularbasementmembranestructurebasicallynormaluniformthickness,podocytestructurewasnormal,podocytewithoutV 成都医学院硕士学位论文apoptosisandshedding.Modelgroupglomerularbasementmembrane(GBM)thickeningwaswide,andfootprocessesbecomewide.Podocytelosswasalsoobserved.Comparedwithcontrolgroup,eachPlumulaNelumbinisextractgroupcansignificantlyreducethethicknessoftheglomerularbasementmembrane(P<0.01),significantlyreducethefootprocesswidth(P<0.01),andincreasethenumberofpodocytes,whichrepresentadosedependentproperties.3.EffectofPlumulaNelumbinisextractonrenalNADPHoxidaseactivityoftheratsDMgrouprenalNADPHoxidaseactivitysignificantlyincreased,theinterventiongroupPlumulaNelumbinisextractcansignificantlyreducerenalNADPHoxidaseactivityofrats(P<0.01).4.ResultsofNADPHoxidasesubunitp22phox,p67phoxexpressionTheexpressionofNADPHoxidasep22phox,p67phoxinDMweresignificantlyhigherthanthatinthoseinterventiongroup(P<0.01),eachPlumulaNelumbinisextractgroupandcaptoprilcanreducetheexpressionofNADPHoxidasesubunitp22phox,thePlumulaNelumbinisextractgroupsignificantiyreduceNADPHoxidaseactivity(P＜0.01);eachPlumulaNelumbinisextractgroupcansignificantlyreducetheexpressionofp67phox(P<0.01)5.Effectsofneferine,isoliensinineonglomerularandprimaryrenalcellsNADPHoxidaseactivity20umolneferinecaninhibittheactivityofNADPHoxidaseofglomeruliunderthestimulationofHGcomparingtheCNgroupandthedifferenceissignificant.5,10,40umolisoliensininecansignificantlyattenuateHGstimulatedglomerularNADPHoxidaseactivityafter1htreatment.Butaftertreatedfor12h,therewasnosignificantdifferencecoparingwithwhichtreatedbyHG.20umolneferine,isoliensininehasnoeffectonNADPHoxidaseactivityofHGtreatedmesangialcells,whichdetectedbyCM-H2DCFDAprobe.TheresultshowsthefluorescenceintensitycanbeenhancedtreatedbyHG,i.e.theNADPHoxidaseactivity.NADPHoxidaseactivityofPrimarykidneycellcanbeinhibitedbyneferine,isoliensininetreatedbyHG.TheintensityofinhibitionisweakerthanVI 成都医学院硕士学位论文thatofApocynin.Conclusion1.PlumulaNelumbinisextractmaythroughreducingtherenalNADPHoxidaseactivity,decreaserenaloxidativestress,andplayaprotectroleinrenal.2.Neferine,isoliensinine,themainconstituentsfromPlumulaNelumbinisextract,candecreaserenalcellsNADPHoxidaseactivity,whichundertheconditionofhighglucose.KeywordsPlumulaNelumbinisextract;NADPHoxidase;neferine;isoliensinineVII 成都医学院硕士学位论文第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠体内作用研究1.引言糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是影响人类健康的主要疾病，是一种主要由遗传和环境因素引起的慢性代谢疾病，其中30%-40%的糖尿病人会并发糖尿病肾病（Diabetesnephropathy，DN）。其表现为高血压、蛋白尿、水肿及肾功能不全，其主要由于糖尿病代谢异常引发肾小球硬化，DN的病理改变包括血流动力学变化如超滤和过度灌注，肾小球和肾小管不同细胞增殖肥大，基底膜变厚，肾小球基质累积，肾小球硬化和肾小管间质纤维化。DN的发病机理总体机制复杂而且发病因素众多，包括氧化应激、晚期糖基化终末产物的累积，遗传易感性、血流动力学、细胞因子和炎症反应，一旦发生明显的DN，很容易发展到肾脏疾病终末期，需要透析或移植治疗，终末期肾脏疾病的发展是不可逆的，所以早期的预防是有必要的。DN的发病机制复杂，越来越多的体内、外实验表明糖尿病时氧化应激反应增强，其产生的活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）在DN的发生发[1]展中起关键性作用，氧化应激已成为DN发病机制的研究热点。研究表明ROS通过直接损伤和间接损伤引起DN发病，直接影响包括:损害肾小球毛细血管基底膜磷脂，肾小球通透性升高，基底膜增厚，降低硫酸肝素蛋白的合成，损伤肾小球滤过膜电荷和结构屏障，其中NADPH氧化酶与ROS的产生密切相关。由NADPH氧化酶生成的低量ROS可作为第二信使影响氧化还原敏感信号通路。另一方面，当NADPH氧化酶的活性上调时，大量生成的ROS也促进氧化应激的形成。目前研究证实，正常情况下肾脏NADPH氧化酶产生的少量ROS可被耐受，糖尿病时，NADPH氧化酶被激活，参与氧化应激，并作为氧化应激的中心环节，通过形成AGEs、激活PKC和多元醇通路，启动TGF-β1和转录因子(如NF-кB)等途径，改变肾脏血液动力学、影响细胞外基质的重构、[2,3]激活细胞内信号转导等，促进糖尿病肾病的发生和发展，近年NADPH氧1 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究化酶抑制剂如夹竹桃麻素(Apocynin)、Argirein和GK-136901等在不同程度上抑制了NADPH氧化酶或其亚基，在减轻糖尿病肾病的发生和发展方面取得了明显的疗效。越来越多的研究显示，调节NADPH氧化酶的活性，特别是选择性抑制NADPH氧化酶亚基以减弱肾脏的氧化应激，已成为延缓肾功能损害的有效治疗措施。因此，抑制NADPH氧化酶或其亚基的活性日益成为全世界研究的焦点和热点。睡莲科植物莲是一种重要的中草，我国莲子心资源丰富，开发潜力巨大。莲子心中主要含有莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱等生物碱，以及木犀草素、芦丁等黄酮化合物。具有降血压、抗心律失常、抑制血小板聚集、抗氧化及清除活性自由基、抗心肌缺血、松弛平滑肌、强心、抗癌、对脑缺血损伤的[4]保护、改善急性肺损伤及肺纤维化、中枢抑制、降血糖等药理作用。在张敏等人的研究中表明莲子心水、醇提取液对Fenton体系产生的羟自由基和邻[5]苯三酚自氧化产生的超氧阴离子有清除作用。在董兰等人的研究中，莲心提取液的浓度达到1.0mg/mL时，对OH.清除率接近90%，对O2-.的清除率为98.34%，这些结果均表明莲子心提取物具有较强的抗氧化作用，但对NADPH氧化酶的是否有抑制作用未见报道。本次实验旨在通过采用不同剂量的莲子心提取物作用于链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠，通过检测各处理组一系列代谢产物及肾脏病理变化，检测肾脏组织NADPH氧化酶活性和其亚基表达情况，探讨莲心碱提取物对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，为临床应用莲子心提取物防治DN提供实验依据。2.实验材料及方法2.1实验材料2.1.1实验试剂卡托普利片北京京丰制药有限公司莲子心提取物成都苑东药业有限公司2 成都医学院硕士学位论文链脲佐菌素（STZ）sigma胞浆和胞膜蛋白提取试剂盒凯基生物公司NADPH氧化酶活性检测试剂盒上海杰美基因生物技术有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所Braford蛋白浓度检测试剂盒凯基生物ECL检测试剂盒milipore公司P67phoxIgGabcam公司P22phoxIgGabcam公司β-actinIgGsantacruz公司辣根酶标记山羊抗小鼠IgG北京中衫生物技术有限公司上样缓冲液凯基生物公司PMSF凯基生物公司脱脂奶粉sigmaPVDF膜国产尿素氮（BUN）测定试剂盒南京建成生物工程研究所尿蛋白定量测定试剂盒南京建成生物工程研究所白蛋白（ALB）测定试剂盒长春汇力生物技术有限公司总蛋白（TP）测定试剂盒长春汇力生物技术有限公司RatMicroalbuminElisa（尿微量白蛋白测定试剂盒）KAMIYABIOMEDICALCOMPANY，Seattle，USA2.1.2实验仪器血糖仪罗氏卓越型，德国罗氏诊断公司血糖试纸罗氏卓越型配套试纸，德国罗氏诊断公司目测尿糖试纸（高尔宝）广州市花都高宝尔生物技术有限公司UV-730半自动生化分析仪日本岛津组织包埋机金华科迪公司切片机SLEE公司显微镜Olympus公司3 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究酶标仪BioTek凝胶成像系统Bio-Rad电泳仪Bio-Rad纯水系统优普公司层析冷柜北京松源华兴科技发展有限公司生物安全柜Thermo2.1.3试验动物SD大鼠：SPF级，120只，全雄，体重230-260g，许可证编号SCXK(京)2012-0001，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。2.1.4试验环境四川省中医药科学院动物中心SPF级动物房（合格证号为SYXK（川）2008-100），温度20-22℃，湿度52%左右，12h/12h明暗交替。2.2实验方法2.2.1试剂和药物配制1%STZ：配制0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：柠檬酸液：称取柠檬酸2.1g，加入100ml超纯水，即为0.1mol/L柠檬酸溶液；柠檬酸钠液：称取柠檬酸钠2.94g，加入100ml超纯水，即为0.1mol/L柠檬酸钠溶液。取柠檬酸液液50ml、柠檬酸钠液66ml，用PH计调至PH=4.2，即为缓冲液。取100μgSTZ溶于10ml缓冲液，现配现用；4%多聚甲醛固定液：准确称取磷酸二氢钠35.8g，15.6g磷酸氢二钠，加入1L蒸馏水，即为0.1mol/LPBS，再加入多聚甲醛40g，加热溶解至透明；不同浓度莲子心配制：按大鼠体重计算各组莲子心重量，每只大鼠5ml，用蒸馏水配制各组莲心碱提取物；裂解液：在20ml的RIPA裂解液中加入200μLPMSF和200μL的磷酸酶抑制剂，再加入200μLaprotinin、200μLleupeptin分装后，-20℃保存；Tris-Hcl（8.8）：（1）称取181.7gTris置于1L烧杯中；（2）加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解；（3）用浓盐酸调节PH至8.8；（4）高温高压灭菌4 成都医学院硕士学位论文后，室温保存；10%SDS：（1）称取10gSDS置于200mL烧杯中，加入80ml去离子水，68℃加热溶解；（2）加浓盐酸调PH至7.2；30%Acrylamide：称取290gAcrylamide，10gSDS，加入600ml去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至1L，倒入棕色试剂瓶4℃保存；10%（W/V）过硫酸铵：称取1g过硫酸铵，加入10ml的去离子水搅拌溶解，按1ml/支分装于1.5ml的EP管，4℃保存；5×电泳缓冲液：称取Tris151.1g，Glycine94g，SDS5.0g，加入800ml的去离子水，搅拌溶解，加去离子水定容至1L，室温保存，使用时1：4稀释；考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中，量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解，加入100ml的冰醋酸，搅拌均匀，加入650ml的去离子水，搅拌均匀，室温保存；考马斯亮蓝染色脱色液：取100ml醋酸，50ml乙醇于1L烧杯中，加入850ml去离子水充分混匀后室温保存；转膜缓冲液：称取2.9gGlycine，Tris5.8g，SDS0.37g于1L烧杯中，加入600ml去离子水，充分搅拌溶解，使用前加200ml甲醇，配成1L溶液；TBSTBuffer：在1L的烧杯中加入Nacl8.8g，PH8.0的Tris-Hcl20ml，然后加入800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混匀，加去离子水将溶液定容至1L后，4℃保存；封闭缓冲液：称取5g脱脂奶粉加入100ml的TBSTBuffer中，充分搅拌溶解，4℃保存待用。2.2.2糖尿病大鼠模型的建立及分组120只SD大鼠体重230-260g，在适应性喂养一周后，血糖检测正常（随机血糖＜7.0mmol），尿蛋白检测正常。将其禁食不禁水24h，按体重随机分为对照组和造型组，其中对照组为12只。造型组动物经尾静脉注射给予用STZ39mg/kg；对照组则给予等体积的柠檬酸盐缓冲液。72h后，测定血糖和尿糖，将血糖值>16.7mmol/L，尿糖为“+++”的动物作为造模成功的动物用5 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究于下一步试验。选取造模成功大鼠95只，按体重及血糖值随机分为模型组、卡托普利10mg/kg、莲子心提取物20mg/kg、莲子心提取物50mg/kg、莲子心提取物200mg/kg，每日灌胃给药一次，连续给药8周，对照组和模型组则给予等体积的蒸馏水。2.2.3指标检测与方法期间，每周称量一次体重，每两周测一次血糖，每四周测一次尿糖、尿微量白蛋白、尿蛋白、尿肌酐等指标。2.2.3.1血糖的测定采用罗氏血糖仪测定大鼠尾静脉血糖。2.2.3.2尿蛋白、尿微量白蛋白、尿素氮（BUN）检测采用全自动分析仪分析大鼠24h尿蛋白含量。总蛋白采用双缩脲法，白蛋白采用溴甲酚绿法，尿素氮（BUN）采用OPA法检测。2.2.4肾脏组织病理的变化8周后，处死动物取肾脏组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称肾脏体重，计算肾脏指数（肾脏重量/大鼠体重），并用4%甲醛固定，以进行HE染色，观察其病理损伤情况，右侧肾组织其余部分液氮保存，备用。取左侧肾组织，4%多聚甲醛固定24h，将组织切成2mm厚，按下述顺序脱水，75%酒精2h，80%酒精2h，90%酒精2h，95%酒精2h，无水酒精2h×2，二甲苯透明20min，浸腊（63℃，1.5h×2），石蜡包埋，切成4μm厚的切片，进行HE染色。HE染色具体步骤：（1）切片常规脱蜡入水；（2）苏木素染细胞核1-2min，水洗；（3）入1%盐酸乙醇分化数秒，水洗；(3)入1%盐酸乙醇分化数秒，水洗；（4）氨水返蓝数秒；（5）流水冲洗，镜下观察细胞核成蓝色；（6）1%伊红染数秒，水洗；（7）梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。染色结果：细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，其他成分呈深浅不同红色。3电镜观察步骤：（1）取材：大小约1mm的肾脏组织；（2）固定：组织块置于2.5%戊二醛和PBS配制的电镜液中4℃固定过夜，固定液充分没过标本，6 成都医学院硕士学位论文然后在0.1M磷酸漂洗液15min×3次，1%锇酸固定液固定2h，PH7.3-7.4，缓冲液漂洗20min，进行脱水；（3）脱水：4℃冰箱酒精脱水，50%、70%、80%、90%乙醇脱水10-15min，90%丙酮10-15min，100%丙酮室温15-20min，重复3次。（4）包埋：纯丙酮+包埋液（2:1）室温3-4h，在药用空心胶囊进行包埋操作，把胶囊放在在特制支架上，烘干，用牙签挑起组织块置于胶囊底部，灌满配制好的Epon812包埋剂，在60℃烘箱中加温24-36h，形成包埋块。（5）切片：超薄切片机切成50-60nm；（6）染色：用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色；（7）观察：透射电镜观察。2.2.5光度法定量检测组织NADPH氧化酶活性检测实验原理：底物还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸（NADPH），在特异性抑制剂联苯基三碘（diphenylen，DPI）存在的情况下，受到NADPH氧化酶的催化作用，转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酸磷酸（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的特异活性。2.2.5.1蛋白提取取肾皮质500mg左右，加入3mlReagentA清洗，移入液氮冻存管，放入液氮冻存管过夜，次日从液氮冻存管取出，加入500μlReagentB，用玻璃匀浆器冰上匀浆60次左右，匀质镜检细胞破碎率≥90%；即可放入4℃台式离心机，3000rpm离心10min，弃沉淀；取上清移至新冷离心管中，4℃，14000rpm离心30min，上清移至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；离心所得沉淀，加入1ml冷的抽提buffer，涡旋震荡混匀后，4℃放置10-15min，4℃，3000rpm离心5min，取上清移至新管，37℃水浴10min，室温，13000rpm离心5min，样品分为上层和下层，弃上层，下层有机相即为胞浆蛋白，分装-70℃保存。2.2.5.2Braford法测定蛋白浓度7 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究（1）标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表加入试剂孔号012345G-250溶液（μL）195195195195195195去离子水（μL）543210蛋白质标准溶液（μL）012345蛋白质含量（μg）012345(2）把酶标板放在振荡器上震荡30s，放置2min后再次震荡，在595nm下比色测定，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；(3）样品和PBS以1:4比例稀释，使稀释样品的总体积为5μL，加入考马斯亮蓝G-250溶液195μL，充分混匀，放置2min，以标准曲线0号管做参比，在595nm波长比色，记录吸光度值；(4）根据所测样品的吸光值，在标准曲线即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释总体积（5μL），乘以样品的稀释倍数即为样品的实际浓度。2.2.5.3背景对照测定ReagenntC室温预热，移取195ulReagenntC到96孔板，加入25ulReagentD，加入5ulReagentF，30℃放置3min，加入25ulReagentE，重复2个孔，作为背景对2.2.5.4样品总活性测定ReagenntC室温预热，移取195ulReagentC到96孔板，加入20ulReagentD，加入5ulReagentF，30℃放置3min，加入20μL待测样品，混匀，放入分光光度仪，340nm波长，每隔1min读数1次，共读5min，样品总活性即为：OD(0min)-OD(5min)，重复2个孔。2.2.5.5样品非特异性活性测定在1.5ml的离心管中加入20μLReagentG，加入100μL待测样品，30℃静置5min，放入冰盒备用；移取190μL预热的ReagentC到96孔板，加入25μLReagentD，再加入5μLReagentF，30℃放置3min，加入冰盒里30μL含有ReagentG和待测样品的溶液，混匀，即刻放入分光光度仪，读取340nm处的吸光度，每隔1min读数1次，共读5min，即为样品非特异性活性：8 成都医学院硕士学位论文OD(0min)-OD（5min），重复2个孔。2.2.5.6计算样品活性(1)[(样品读数-背景读数)×0.25（ml）×样品稀释倍数]÷[0.025(ml)×6.22（毫摩尔吸光系数）×5（反应时间：min）]=单位/毫升或微摩尔NADPH/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克或微摩尔NADPH/分钟/毫克(2)样品特异性活性样品总活性-样品非特异性活性=样品特异性活性2.2.6WB检测组织NADPH氧化酶亚基p67phox、p22phox表达情况2.2.6.1组织蛋白提取取出液氮中组织，剪下一小块，称重，剪碎，冰PBS洗干净血液，加入适当裂解液，用电动匀浆机冰上匀浆，直至组织裂解完成。样品组织重量（mg）裂解液（ul）空白组60.7600模型组104.61000卡托普利组67.6670莲子心低剂量组(20mg/kg)1381380莲子心中剂量组(50mg/kg)91.3900莲子心高剂组(200mg/kg)85.8850裂解完后，4℃，10000r/min离心30min，取上清，用BCA法测蛋白浓度。2.2.6.2BCA测蛋白浓度(1)取适量25mg/ml蛋白标准，用PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL。(2)按50体积BCA试剂A加1体积的BCA试剂B(50:1)配制适量的BCA工作液，充分混匀，备用。(3)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μL。(4)加适当体积样品到96孔板中，加标准品稀释到20μL。(5)各孔加200μLBCA工作液，37℃放置30min。9 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究(6)测定A562，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。样品蛋白浓度上样量（μL）蛋白上样缓冲液（μL）（μg/ml）空白组423.523.66模型组588174.3卡托普利组434.5236莲子心低剂量组（20mg/kg）760133莲子心中剂量组(50mg/kg)561.517.84.5莲子心高剂量(200mg/kg)8291232.2.6.3制胶按下表制分别制12%、10%分离胶（1.5mm），10%分离胶（1mm），进行电泳。12%分离胶配方（5ml用于两块胶）：H2O1.6ml30%Acrylamide2.0ml1.5MTris-HCl（PH8.8）1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml10%分离胶配方：H2O1.9ml30%Acrylamide1.7ml1.5MTris-HCl（PH8.8）1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml混匀后加入1.5ml左右至1.5mm左右的胶槽中至适当高度，用异丙醇覆盖，室温放置30-60min至分离胶凝固，配制5%浓缩胶。10 成都医学院硕士学位论文5%浓缩胶配方（3ml用于两块胶）：H2O2.1ml30%Acrylamide0.5ml1.5MTris-HCl（PH6.8）0.38ml10%SDS0.03ml10%过硫酸铵0.03mlTEMED0.003ml倒掉分离胶上的异丙醇后，用滤纸吸干（滤纸不要接触胶面），加入浓缩胶，灌胶后迅速插入梳子，室温放置30-40min凝固。2.2.6.4加样(1)待浓缩胶聚合后，拔去梳齿用去离子水冲洗加样孔，除去残留的未聚合的胶，然后将玻璃板装入电泳槽；(2)将lx电泳缓冲液加入内外电泳槽中，确保凝胶的上部和底部都浸入缓冲液中，将样品加入上样孔中，每孔100μg蛋白；(3)以120V恒压电泳，待指示剂溴酚蓝接近浓缩胶的底部后用80V恒压跑分离胶，直至溴酚蓝条带跑到分离胶底部，停止电泳。2.2.6.5转膜(1)电泳完毕，关闭电源，将玻片架从电泳槽中取出，卸下玻片，取出凝胶，以Marker为对照，按不同分子量将p22phox、p67phox、β-actin切开；(2)剪6块滤纸和3张PVDF膜，其大小与切下来的胶相同，使用前放入先放入甲醇浸泡1min左右，后放入转膜缓冲液中平衡10-15min；(3)按顺序装好滤纸、胶、PVDF膜，确保各层精确对齐，每铺一层用玻璃管滚筒挤出气泡；(4)置入转膜夹内，转膜夹放入转膜槽中，并在转膜夹前后放入两块冰袋，放入4℃层析柜，盖好转膜槽盖，凝胶一侧接负极（黑色），膜一侧接正极（红色）。(5)200mA恒流转膜90min。11 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究2.2.6.6封闭脱脂奶粉常温封闭2h。2.2.6.7一抗孵育P67phox浓度按1:2000稀释，β-actin浓度按1：5000稀释，摇床4℃过夜，次日在摇床上用TBST洗膜3次，每次15min。2.2.6.8二抗孵育P67phox来源为兔源，故加入山羊抗兔的二抗，按1:5000稀释二抗，β-actin来源为鼠源，加入山羊抗鼠的二抗，浓度为1:10000，37℃孵育2h，在摇床上用TBST洗膜3次，每次15min。2.2.6.9显色(1)分别取ECL试剂盒中SolA1.0ml，SolB1.0ml，混匀，将膜放于保鲜膜上，使吸附有蛋白质的一面朝上，加ECL混合液于膜上，均匀覆盖膜，用凝胶成像系统成像。(2)曝光时间为3min，每10s曝一张，开始曝光时间为30s。2.3统计学分析SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据均用均数±标准差（⎯x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），均数间的两两比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。3.实验结果3.1各组大鼠各时间点体重的比较大鼠在给予STZ后，其体重增加减慢，与对照组比较有统计学差异（P＜0.01）。莲子心提取物各剂量组及卡托普利能降低DN大鼠体重，与模型组比较无统计学意义（P＞0.05）（表1-1、表1-2）。12 成都医学院硕士学位论文表1-1各组大鼠各时间点体重的比较（⎯x±S）Tab1-1Comparsionofratweightofeachtimepointamongthesixgroup(⎯x±S)组别剂量体重（g）(mg/kg)N药前药后1W药后2W药后3W药后4W对照组-12355±8.9**396±26.7**413±30.0**435±30.2**452±30.5**模型组-11295.8±17.0316.7±16.1306.3±23.1326.0±25.1333.1±29.8卡托普利1012297.0±23.6299.3±36.8296.6±46.5303.7±49.5304.7±54.9组莲子心低2013299.9±38.4304.6±57.1320.1±66.4324.8±79.4334.7±87.7剂量组莲子心中5013300.9±31.3308.9±48.4309.0±62.6313.5±72.9320.0±82.4剂量组莲子心高20013301.0±24.4304.9±27.8312.9±43.3316.5±55.3325.8±59.9剂量组注：与模型组比较：**P<0.01表1-2各组大鼠各时间点体重的比较（⎯x±S）Tab1-2Comparsionofratweightofeachtimepointamongthesixgroup(⎯x±S)体重（g）剂量组别N(mg/kg)药后5W药后6W药后7W药后8W对照组-12467.0±32.2**481.1±35.7**494.1±36.7**505.7±39.6**模型组-11333.9±33.0334.3±38.9334.4±42.2351.6±41.6卡托普利1012302.9±63.4312.3±71.6317.9±74.4325.7±77.1组莲子心低2013339.4±94.5342.6±100.7340.9±107.2354.2±111.6剂量组莲子心中5013328.7±89.2332.7±96.9337.6±103.4340.0±109.6剂量组莲子心高20013333.4±71.1344.2±82.7347.6±88.9355.4±94.4剂量组注：与模型组比较：**P<0.01，莲子心20mg/kg组药后8w动物数为12只。13 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究3.2各组大鼠血糖水平的比较在静脉注射STZ39mg/kg后72小时，其血糖水平显著增高，并一直维持到试验结束，与对照组比较有统计学差异（p＜0.01）；莲子心提取物各剂量组及卡托普利对DN大鼠血糖水平无明显影响，与模型组比较无统计学差异（p＞0.05）（表1-3）。表1-3各组大鼠血糖的比较（⎯x±S）Tab1-3Comparsionofratbloodglucoseamongthesixgroup（⎯x±S）剂量血糖（mmol/L）组别N(mg/kg)药前药后2W药后4W药后6W药后8W对照组-126.2±0.6**6.1±0.6**7.2±0.8**6.8±1.0**6.3±0.8**模型组-1124.6±7.229.7±4.830.0±4.330.6±5.130.1±7.9卡托普利组101227.2±5.730.8±5.730.2±6.429.2±9.330.2±7.0莲子心低剂量组201326.2±5.929.7±7.328.1±10.426.4±9.329.0±6.4莲子心中剂量组501327.1±5.829.5±8.129.0±7.230.2±6.131.0±5.3莲子心高剂量组2001324.1±5.230.8±4.427.5±8.228.6±8.130.7±6.3注：与模型组比较：**P<0.01，药后2周的血糖测定时间为给药后24小时，药后4W、药后6W以及药后8W的血糖测定时间为给药后1小时。莲子心20mg/kg组药后8w动物数为12只。3.3各组大鼠尿糖水平的比较大鼠尿糖按测定结果打分：“-”为0分，“±”为0.5分，“+”为1分，“++”为2分，“+++”为3分，“++++”为4分，结果用秩和检验。由表1-4可见，大鼠在注射STZ后，其尿糖水平持续升高，与对照组比较有统计学差异；各药物组及卡托普利对DN大鼠尿糖水平无明显影响，与模型组比较无统计学差异（p＞0.05）（表1-4）。14 成都医学院硕士学位论文表1-4各组大鼠尿糖水平的比较（⎯x±S）Tab1-4Comparsionofraturineglucoseamongthesixgroup（⎯x±S）剂量尿糖（分值）组别N(mg/kg)药前药后4W药后8W**0.0±0.0**0.0±0.0**对照组-120.0±0.0模型组-113.6±0.53.8±0.63.6±1.1卡托普利组10123.8±0.43.4±1.43.4±1.4莲子心低剂量组20133.7±0.53.2±1.53.4±1.4莲子心中剂量组50133.8±0.43.5±1.33.5±1.3莲子心高剂量组200133.8±0.43.6±1.13.0±1.5注：与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01，莲子心20mg/kg组药后8w动物数为12只。3.4各组大鼠微量蛋白量的比较大鼠给予STZ后，其尿微量白蛋白显著增加（P＜0.01）。莲子心各剂量和卡托普利均能降低DN大鼠尿微量白蛋白，与模型组比较有统计学差异（P＜0.01），莲子心提取物50mg/kg表现出较明显的减少大鼠尿微量白蛋白作用,8w末降低作用强于4w末（表1-5）。表1-5各组大鼠微量蛋白量的比较（⎯x±S）Tab1-5Comparsionofunrinemicroalbuminamongthesixgroup（⎯x±S）微量白蛋白（μg/24h）剂量组别N(mg/kg)药后4W药后8W对照组-1038.12±14.42**53.05±18.62**模型组-101740.58±879.251394.19±326.18卡托普利组1010557.74±138.51**242.80±128.19**莲子心低剂量组2010273.84±64.78**196.3±144.2**莲子心中剂量组5010107.06±32.54**88.1±19.03**莲子心高剂量组20010179.42±45.18**165.25±54.41**注：与模型组比较：**P<0.0115 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究3.5各组大鼠尿蛋白水平的比较大鼠给予STZ后，其尿蛋白明显增加（P＜0.01）。莲子心各剂量组能降低DN大鼠尿蛋白，与模型组比较有统计学差异（P＜0.01）卡托普利4w对大鼠的尿蛋白量无明显影响,8w末表现出显著降低大鼠尿蛋白作用（P＜0.01）（表1-6）。表1-6各组大鼠尿蛋白水平的比较（⎯x±S）Tab1-6comparsionofurineproteinamongthesixgroup（⎯x±S）剂量尿蛋白量（mg/24h）组别N(mg/kg)4W8W对照组-1215.0±4.7**12.9±4.7**模型组-11225.8±12.2366.4±202.9卡托普利组1012229.3±23.8276.1±34.3**莲子心低剂量组20.01335.5±22.2**69.1±48.8**莲子心中剂量组50.01333.5±18.5**79.3±44.7**莲子心高剂量组200.01340.1±26.5**67.3±52.2**注：与模型组比较：**P<0.013.6各组大鼠SCr、BUN的比较莲子心提取物各剂量组增加各组大鼠SCr，与模型组比有统计学差异(P＜0.01)；莲子心提取物20mg/kg能增加大鼠BUN，与模型组比有统计学差异（P＜0.05），其余各剂量和卡托普利对大鼠BUN无明显影响（表1-7）。表1-7各组大鼠SCr、BUN的比较（⎯x±S）Tab1-7ComparsionofSCr、BUNamongthesixgroup（⎯x±S）剂量SCrBUN组别N(mg/kg)（mg/L)(mmol/L)**5.81±0.39**对照组-1256.5±9.0模型组-1170.4±10.17.52±1.26*9.79±3.70卡托普利组101282.1±12.7**6.34±1.10*莲子心低剂量组20.01382.9±7.916 成都医学院硕士学位论文**8.11±2.67莲子心中剂量组50.01390.6±15.9**7.24±2.56莲子心高剂量组200.01385.1±11.5注：与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01，莲子心20mg/kg组药后8w动物数为12只3.7各组大鼠肾脏病理结果比较莲子心50mg/kg与莲子心200mg/kg均可显著减少DN大鼠肾脏组织损伤的动物数，与模型组比较有统计学意义（P＜0.05）。给药8w后，DN大鼠肾指数增加，与对照组比较有统计学差异（P＜0.01），莲子心各剂量组和卡托普利对DN大鼠肾指数无明显影响（P＞0.05）（表1-8）。按照如下标准对各组大鼠肾脏病理切片进行分级：病灶占总面积的比例＜5%为1级，病灶占总面积的比例5-25%为2级，病灶占总面积的比例25%-50%为3级，病灶占总面积的比例50%-75%为4级，病灶占总面积的比例＞75%为5级，结果用秩合检验进行分析。HE染色后，显微镜下可见，对照组：肾脏肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生。模型组：11例肾标本肾小管上皮空泡变性（6例1级，4例2级，1例3级）；所有标本肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；卡托普利组：10例肾标本肾小管上皮空泡变性（4例1级，6例3级）；其余肾标本肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；莲子心20mg/kg组：10例肾标本肾小管上皮空泡变性（1例1级，9例2级）；其余肾标本肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；莲子心50mg/kg组：7例肾标本肾小管上皮空泡变性（3例1级，3例2级，1例3级）；其余肾标本肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；莲子心200mg/kg组：8例肾标本肾小管上皮空泡变性（2例1级，4例2级，2例3级）；其余肾标本肾小球结构清晰，基底膜未见明显增厚，肾小管上皮形17 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究态正常，未见管型，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生（附图1）。电镜结果显示，对照组肾小球基底膜结构基本正常，厚度均匀，足突结构正常，足细胞无凋亡、脱落；模型组肾小球基底膜增厚（表1-9），足突增宽、扁平，足突融合，足细胞减少；莲子心高、中、低剂量组均能显著降低DN大鼠肾小球基底膜厚度（p＜0.01），显著降低足突宽度（p＜0.01），使足细胞数增多，并呈一定的剂量依赖关系（图1-1、附图2）。表1-8各组大鼠肾脏病理结果比较（⎯x±S）Tab1-8Comparsionofrenalpathologyamongthesixgroup（⎯x±S）剂量肾脏指数肾脏组织病变动组别病理评分(mg/kg)N（g/100g）物数对照组-120.0±0.0**0.66±0.04**0模型组-111.55±0.691.02±0.1911卡托普利组10121.83±1.271.07±0.2210莲子心低剂量组20.0121.58±0.790.99±0.2810莲子心中剂量组50.0130.92±1.031.06±0.267*莲子心高剂量组200.0131.23±1.171.02±0.218*注：与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01。18 成都医学院硕士学位论文图1-1各组大鼠肾小球透射电镜统计结果（12000×）Fig1-1Statisticalresultsofglomerularwithelectronmicroscopeamongthesixgroup（12000×）3.8大鼠各处理组肾脏NADPH氧化酶活性结果由下图可见，模型组大鼠肾脏NADPH氧化酶活性明显提高，与空白组比较有明显统计学差异，莲子心提取物20mg/kg、50mg/kg、200mg/kg均能降低大鼠肾脏NADPH氧化酶活性，与模型组比较，20mg/kg的莲子心提取物差异较显著（P＜0.01），50mg/kg、200mg/kg莲子心差异具有统计学意义（P＜0.05）。19 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究图1-2各组大鼠肾脏组织NADPH活性比较Fig1-2ComparisonofNADPHactivityofratsrenaltissue注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.053.9各处理组大鼠NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox表达的比较WB结果显示模型组NADPH氧化酶p22phox、p67phox表达明显增加，与空白组比较有显著差异（P＜0.01)，莲子心提取物各剂量组及卡托普利能减少NADPH氧化酶亚基p22phox的表达，其中莲子心提取物各剂量组差异较显著（P＜0.01）；莲子心各剂量组均能减少NADPH氧化酶亚基p67phox的表达，与模型组比，有较显著差异（P＜0.01），卡托普利对p67phox表达的影响无统计学差异。20 成都医学院硕士学位论文图1-3各组大鼠肾皮质NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox表达结果Fig1-3ResultoftheexpressionofNADPHoxidasesubunitp22phox,p67phoxintherenalcortexofeachgroup4.讨论及结论近年来，糖尿病在全球范围内发病率快速增长，是仅次于肿瘤和心血管疾病的常见病。近一半的1型或2型糖尿病会发展为糖尿病肾病，1/3的糖[6]尿肾病患者会发展到终末期肾脏疾病（ESRD），危害人类的健康。糖尿病肾病主要的病理特点是肾小球肥大、毛细血管基底膜增厚、系膜基质增生和肾[7]小球细胞外基质（ECM）积聚，最终引起肾小球硬化。DN的发病机制主要包括多元醇通路激活、蛋白非酶糖基化和糖基化终末（AGEs）产物的产生及多种细胞因子的共同作用。如何有效预防、治疗DN，延缓DN的发展，是医学界共同关注的问题。中药防治DN已成为DN治疗方法的一个研究热点。氧化应激是糖尿病肾病的一个很重要的发病机理，动物实验中可通过检21 第一部分莲子心提取物对糖尿病大鼠的体内研究测8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷（8-OHdG），测量血及尿中的异前列腺素类化合物F2及丙二醛来反映大鼠肾脏氧化应激的水平。正常情况下，活性氧（ROS）的产生和消除处于动态平衡，当ROS产生过多时，其通过损伤蛋白质、脂质和核酸，产生不良影响，其还可通过激活细胞内的信号转导系统如细胞外信号调节激酶、促分裂原活化蛋白激酶，活化转录因子如NF-κB，活化核内激[8]活蛋白，表达相应的活化产物，最终使细胞外基质增多，降解减少，导致ECM聚集。在本实验中，采用STZ来复制糖尿病大鼠模型。STZ是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，通过GLUT2葡萄糖转运蛋白进入细胞，对胰岛素β细胞有毒性，实验采用一次性大剂量注射方式给药，本实验采用一次性尾静脉注射39mg/kgSTZ方式造模，本研究发现大鼠在静脉注射STZ后72小时，其血糖水平显著升高升高，并出现糖尿病三多一少的典型症状（食量多、饮水多、尿量多，体重增加减少），STZ大鼠总死亡率8.4%，其中模型组死亡率为21.4%，莲子心200mg/kg死亡率最低，为0%，但各组与模型组比较无统计学差异。由于ROS可启动足细胞凋亡，诱导其从基底膜脱落，使肾小球内足细胞数量减少，足细胞受损后缺乏增殖再生的修复能力，不能覆盖基底膜，肾小球滤过膜完整性破坏，导致蛋白尿发生，其还可通过使毛细血管基底膜发生脂质过氧化使肾小球通透性增加，血浆蛋白易于通过内皮细胞沉积于基底膜，导致基底膜增厚，故在造模后期出现微量蛋白、蛋白尿等糖尿病肾病典型表现，并在造模后8周后肾脏组织出现严重损伤，基底膜出现缺损或增厚、胶原堆积等糖尿病肾病早、中期典型表现。卡托普利主要通过2种方式降低DN大鼠蛋白：1.改善肾内细胞环境，减少尿蛋白分泌与排泄；2.改善肾小球滤过膜通透性，降低尿蛋白滤出率。NADPH氧化酶激活产生大量的ROS，在DN一个很重要的发病机制，血管紧张素Ⅱ诱导NADPH氧化酶的表达和激活，血管紧张素转化酶抑制剂，如卡托普利能有效抑制NADPH氧化酶起到降低DN大鼠微量白蛋白的作用。莲子心味苦性寒，具有清心去热，固肾涩精的功效，文献研究显示莲子22 成都医学院硕士学位论文心具有清除自由基、抗氧化作用，本研究采用莲子心提取物干预治疗4、8周后，发现尿白蛋白、微量白蛋白排泄显著减少，与模型组比有显著差异，并表现出一定浓度依赖特性。电镜结果显示各药物组均可显著降低DN大鼠肾小球基底膜的厚度莲，显著降低足突宽度，使足细胞数增多，并表现出一定的剂量依赖特性，进一步证实了莲子心提取物的肾脏保护作用。研究发现莲子心提取物干预组尿糖及血糖水平与糖尿病模型组相近，差异无统计学意义，提示莲子心提取物的肾脏保护作用不依赖血糖的降低。NADPH氧化酶与肾脏氧化应激密切相关，NADPH氧化酶由5个亚基组成：2个膜亚基gp91phox、p22phox组成膜复合体b558，3个胞质亚基p47phox、p40phox、p67phox，静息状态下，NADPH氧化酶无活性，在受到刺激的情况下，NADPH氧化酶通过其胞质成分p47phox的磷酸化与p67phox的移位，再与胞膜成分gp91phox和p22phox聚集而活化，以NADPH作为电子供体，将O2催化为O2-。在本实验中检测了各处理组NADPH氧化酶的活性及相关蛋白的表达，本研究发现莲子心提取物可抑制糖尿病大鼠NADPH氧化酶活性，减少NADPH氧化酶亚基p22phox、p67phox的表达，与模型组比较有显著差异，NADPH氧化酶其他亚基的表达情况还需进一步研究。以上种种结果提示莲子心提取物可能通过抑制大鼠肾脏NADPH氧化酶活性，减弱肾脏氧化应激，发挥肾脏保护作用。23 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响1.引言糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病常见的严重并发症之一，其基本病理改变包括肾小球基底膜增厚，肾小球滤过膜受损和肾间质纤维化等，临床上出现蛋白尿和肾功能损伤等症状。糖尿病肾病发病机制非常复杂，糖尿病肾病（DN）的发病机制主要与肾脏血流动力学改变、多元醇代谢途径异常、蛋白质非酶糖化和大分子糖基化终末产物（AGEs）的生成、细胞因子的异常及基因多态性、细胞凋亡、脂代谢紊乱、钙分布异常等因素密切相关。其中，氧化应激产生的活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）在DN的发生发展上其关键作用。2001年Brownlee提出了糖尿病并发症的“氧[9]化应激”统一机制学说，认为高糖引起超氧阴离子(ROS)生成过多，继而引发组织细胞发生氧化应激，最终导致糖尿病的各种并发症。ROS是氧激发的化学性质十分活泼的分子，包括氧自由基和非自由基的含氧产物，如O2-、OH等。正常情况下，活性氧的产生和清除处于动态平衡，当活性氧产生超过其清除能力，造成体内蛋白质、核酸等生物大分子的损伤。ROS的产生最主要包括线粒体呼吸传递链、NADPH氧化酶等途径，通过直接和间接作用损伤肾脏组织，其中，NADPH氧化酶与ROS的产生密切相关。NADPH氧化酶是一种与胞浆膜相关的酶，广泛分布吞噬细胞及心、肝、肾、血管内皮等非吞噬细胞组织中，其以胞质NADPH为电子供体，催化胞外-的O2生成超氧阴离子（O2）。NADPH氧化酶最早在吞噬细胞中发现，是一种多酶复合物，由5个亚基组成：2个膜亚基gp91phox、p22phox，两者构成膜复合体细胞色素b558；3个胞质亚基p47phox、p40phox和p67phox，除此以外，[10]还有2个低分子量的GTP结合蛋白Rac1、Rac2，gp91phox包括一系列同系物NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2，统称NOX家族。NOX224 成都医学院硕士学位论文主要在系膜细胞、足细胞、内皮细胞表达，NOX4主要在在肾小球、近曲小管、[11]远端集合管。糖尿病时体内氧化应激水平明显升高，NADPH氧化酶是糖尿病高水平ROS重要来源之一。Apocynin主要从参科植物黄边的根茎中分离得到，具有抗氧化活性，是NOX非特异性抑制剂，其能抑制NADPH氧化酶的组装，但需要过氧化物酶激活。Apocynin的药理作用表现在降低关节炎、哮喘模型中活性氧的产生，以依赖NOX方式抑制激动剂引起的血小板活化。在某些实验条件下，其不能抑[12]制NADPH氧化酶，只能清除ROS。在对小檗的研究中发现，其能抑制LPS[13]刺激的巨噬细胞中超氧阴离子的产生，机理主要是小檗碱能选择性抑制[14]gp91phox的表达，增强超氧化物歧化酶活性。大黄提取物大黄素能通过抑制NADPH氧化酶p47phox活化，降低ROS的产生，发挥治疗动脉粥样硬化的[15]作用。绿茶（GT）能够减弱高血压引起的氧化应激，减轻肾脏损伤，GT能改善大鼠蛋白尿和肾脏胶原蛋白Ⅵ的累积，并减少自发高血压（SHR）大鼠的肾脏氧化应激，其机理主要通过下调NDPH氧化酶的NOX4的表达。由此看出，[16-18][19]NADPH氧化酶抑制剂如夹竹桃麻素(Apocynin)、Argirein和[2]GK-136901等在不同程度上抑制了NADPH氧化酶或其亚基，在减轻糖尿病肾病的发生和发展方面取得了明显的疗效。越来越多的研究显示，调节NADPH氧化酶的活性，特别是选择性抑制NADPH氧化酶亚基以减弱肾脏的氧化应激[20][21,22]，已成为延缓肾功能损害的有效治疗措施。因此，抑制NADPH氧化酶或其亚基的活性日益成为全世界研究的焦点和热点[23]甲基莲心碱、异莲心碱是莲子心中的主要生物碱。在刘双梅等人的研究中发现甲基莲心碱可降低糖尿病大鼠的血糖，主要通过抗炎、抗氧化应激作用，改变糖尿病大鼠的代谢产物。甲基莲心碱治疗2型糖尿病大鼠后，能使其体重、血压、空腹血糖、总胆固醇和甘油三酯下降，增加高密度脂蛋白，下调2型糖尿病大鼠颈上神经节CCL5和CCR5的表达。研究表明，甲基莲心碱通过减少活性氧的形成，TBARS的产生，LDH的释放及增加GSH的产生来减[24]弱t-BHP诱导的氧化应激。MDA是细胞膜脂质过氧过氧化终产物之一，王[25][26]辉等人的研究表明异莲心碱具有脂质抗氧化作用。在徐俊英的研究中，25 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响异莲心碱对脑I/R有保护作用，研究提示该作用与其抗氧化和抗自由基损伤有关。甲基莲心碱、异莲心碱能减弱氧化应激，但是否能抑制NADPH氧化酶仍未见报道。前期研究采用莲心提取物对STZ所致糖尿病肾病大鼠进行8周的干预，结果显示能降低糖尿病肾病大鼠尿白蛋白，恢复足细胞数量、缩小足突宽度、减轻基底膜增厚以及肾间质纤维化等，对糖尿病肾病功能和病理损害明显改善，本研究在前期研究的基础上进一步探讨莲子心提取物中甲基莲心碱、异莲心碱对原代分离肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响。2.材料与方法2.1实验试剂及设备2.1.1主要试剂及配制方法PRMI1640培养基Hyclone公司胎牛血清Gibco公司青链霉素索来宝公司胰酶Hyclone牛胰岛素sigma胶原酶VsigmaCM-H2DCFDALifetechnology公司甲基莲心碱成都曼斯特生物科技有限公司异莲心碱成都曼斯特生物科技有限公司夹竹桃麻素sigmaDMSOApplicemCytochromeCsigmaPBS中衫完全培养基配制：RPMI1640+15%胎牛血清（FBS）+5ug/mL胰岛素+1%双抗甲基莲心碱配制：无菌条件称取25.0mg甲基莲心碱，加入1mlDMSO，溶解后，配成浓度为40mM的储备液；26 成都医学院硕士学位论文异莲心碱配制:无菌条件称取24.43mg异莲心碱，加入1mlDMSO，溶解后，配成浓度为40mM的储备液；10mm夹竹桃素配制：无菌条件称取1.66mg夹竹桃素，溶于1mlDMSO,配制成浓度为10mm的储备液；CytochromeC配制：准确称取8.87mgCytochromeC溶于10mlPBS，0.22μm滤膜过滤，即为100×储备液；CM-H2DCFDA配制：取一只装有50μgCM-H2DCFDA的EP管加入8.6μLDMSO，配制成10mmol/L（1000×）的储备液-20℃避光保存。2.1.2主要设备酶标仪BioTek纯水系统优普公司层析冷柜北京松源华兴科技发展有限公司生物安全柜Thermo倒置荧光相差显微镜Olympus离心机Thermo烘箱Thermo培养箱Thermo细胞筛国产2.1.3实验动物雄性SD大鼠购自四川达硕动物公司体重170g-180g2.2实验方法2.2.1Nef、Iso对HG刺激的肾小球NADPH氧化酶活性的影响2.2.1.1原代肾小球分离[27]6只SD大鼠剪股动脉放血致死，浸泡于75%酒精，无菌条件取肾脏置于3冰的PBS中，剥离肾脏周围脂肪和胞膜，取皮质，剪成1-2mm大小，用PBS尽量把血液洗干净（3-4次），取一部分用于组织块培养，剩下的依次通过20027 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响μm，150μm，80μm筛网，200μm筛网上的组织尽量用玻璃研磨棒研磨碎，用力不要太大，150μm筛网上的尽量只冲洗不研磨，用PBS把80μm筛网上截留的肾小球反冲下来，镜下观察尽量不含肾小管碎片后，停止冲洗；离心，弃上清，加入3mlV型胶原酶充分混匀后，37℃消化30min左右，边消化边观察，使肾小球从胞曼氏囊中剥离，加入含血清的培养基终止消化，所得肾小4球按5×10/well铺于96孔板。2.2.1.2细胞色素（cytochromeC）检测不同浓度莲甲基莲心碱、异莲心碱[28,29]对原代肾小球NADPH氧化酶活性影响将CytochromeC加入96孔板中肾小球使其终浓度为100μm，37℃避光孵育30min，按下述分组进行实验：(1)加无血清空白培养基(Blank)；(2)加入含25mmGlu培养基（CN）；(3)加入含25mmGlu培养基+甲基莲心碱（5、10、20、40μm）；(4)加入含25mmGlu培养基+异莲心碱（5、10、20、40μm）；(5)加入含25mmGlu培养基+500μm夹竹桃麻素（Apocynin），每组设3个复孔，分别在37℃孵育1h、12h测量540nm处的吸光度，扣除空白孔的吸光度，每个浓度重复3个复孔。2.2.2细胞原代培养及NADPH氧化酶活性检测2.2.2.1原代肾小球的分离6只SD大鼠剪股动脉放血致死，浸泡于75%酒精，无菌条件取肾脏置于3冰的PBS中，剥离肾脏周围脂肪和胞膜，取皮质，剪成1-2mm大小，用PBS尽量把血液洗干净（3-4次），取一部分用于组织块培养，剩下的依次通过200μm，150μm，80μm筛网，200μm筛网上的组织尽量用玻璃研磨棒研磨碎，用力不要太大，150μm筛网上的尽量只冲洗不研磨，用PBS把80μm筛网上截留的肾小球反冲下来，镜下观察尽量不含肾小管碎片后，停止冲洗，所得肾小球用PBS吸干净后，加入5ml胶原酶Ⅴ，37℃，消化30min，离心，去2上清，加入5ml完全培养基进行重悬后，移入25cm的塑料培养瓶中37℃，5%CO2进行培养。前5d尽量不动瓶子，第6d起每天观察细胞培养情况，每3d换一次培养基。28 成都医学院硕士学位论文2.2.2.2细胞传代当细胞长满一瓶后，弃原来培养基，用PBS洗3次后，加入适量的0.25%胰酶，使其能充分覆盖培养瓶，37℃消化，边消化边观察，当观察到其变圆，从培养瓶上脱落时加入含血清的培养基终止消化，加入适量的完全培养基后，分装成2瓶或3瓶，37℃继续培养。2.2.2.3细胞冻存(1)0.25%胰酶消化培养细胞，观察到变圆、脱落后加入含血清的培养基终止消化；(2)培养瓶中的液体转移至10ml的离心管中；(3)800r，离心5min；(4)弃上清，加入适量冻存液反复吹打混匀；(5)将混合后的液体移至冻存管（1.8ml），作好标记，放入事先加入异丙醇的冻存盒中，-80℃过夜后，放入液氮罐中永久保存。2.2.2.4CM-H2DCFDA检测细胞NADPH氧化酶活性实验原理：CM-H2DCFDA是一种非极性化学物质，本身没有荧光，能自由通过细胞膜，进入细胞后，在细胞内脱去两个乙基，形成DCFH，DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易装载到细胞内，DCFH与细胞内的自由基发生反应，形成DCF，发出荧光，检测DCF的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。实验方法：[30]5（1）收集对数期的细胞，0.25%胰酶消化后，调整至浓度为1×10/ml；（2）加入无血清的空白培养基饥饿24h，按如下分组加入药物：a.加无血清空白培养基(Blank)；b.加入含25mmGlu培养基（CN）；c.加入含25mmGlu培养基+20μm甲基莲心碱；d.加入含25mmGlu培养基+20μm异莲心碱；e.加入含25mmGlu培养基+500um夹竹桃素，每组设3个复孔，加入药物后放入37℃孵育12h；（3）按1:1000稀释CM-H2DCFDA探针储备液，使其终浓度为10μmol/L，4细胞收集后悬浮于稀释好的CM-H2DCFDA中，细胞浓度为1×10/mL，37℃细29 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响胞培养箱内孵育20min，每隔3-5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；（4）用无血清的培养基洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的CM-H2DCFDA；（5）用倒置荧光显微镜成像，用蓝色的光激发。2.3统计学分析SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据均用均数±标准差（⎯x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），均数间的两两比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。3.实验结果3.1不同浓度的Nef、Iso对肾小球NADPH氧化酶活性的影响3.1.1不同浓度的Nef处理对高糖（HG）处理的肾小球1h的NADPH氧化酶活性的影响由图2-1可见，HG处理后能明显提高肾小球NADPH氧化酶活性，与空白组比较具有显著统计学差异，5μmol、20μmolNef处理1h后，能减弱HG处理的肾小球的NADPH氧化酶活性，与CN组比较，差异具有统计学差异（P＜0.05），10μmol、40μmol的Nef处理后与CN组比较没有明显差异（P＞0.05）。图2-1不同浓度Nef对肾小球NADPH氧化酶活性的影响Fig2-1EffectsofdifferentconcentrationofNefontheactivityofNADPHoxidaseofglomerular注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.0130 成都医学院硕士学位论文3.1.2不同浓度的Iso处理对高糖（HG）处理的肾小球1h的NADPH氧化酶活性的影响由图2-2可见，HG处理后能明显提高肾小球NADPH氧化酶活性，与空白组比较具有显著统计学差异，5、10、40μmolIso处理1h后，能减弱HG处理的肾小球的NADPH氧化酶活性，与CN组比较，差异具有统计学意义，20μmol的Iso处理后与CN组比较没有明显差异（P＜0.05）。图2-2不同浓度Iso对肾小球NADPH氧化酶活性的影响Fig2-2.EffectsofdifferentconcentrationofIsoontheNADPHoxidaseactivityofglomerular注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.013.1.3不同浓度的Nef处理对高糖（HG）处理的肾小球12h的NADPH氧化酶活性的影响由图2-3可见，HG处理12h后，能显著提高肾小球NADPH氧化酶活性，不同浓度的Nef处理后与CN组比较，均无明显差异（P＞0.05）。31 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响图2-3不同浓度Nef对肾小球NADPH氧化酶活性的影响Fig2-3EffectsofdifferentconcentrationofNefontheactivityofNADPHoxidaseofglomerular注：与模型组比较，△P＜0.053.1.4不同浓度的Iso处理对高糖（HG）处理的肾小球12h的NADPH氧化酶活性影响由图2-4可见，HG处理12h后，能显著提高肾小球NADPH氧化酶活性，不同浓度的Iso处理后与CN组比较，均无明显差异（P＞0.05）。图2-4不同浓度Iso对肾小球NADPH氧化酶活性的影响Fig2-4EffectsofdifferentconcentrationofIsoontheactivityofNADPHoxidaseofglomerular注：与模型组比较，△P＜0.0532 成都医学院硕士学位论文3.2原代培养的细胞形态学观察系膜细胞外表拉长，呈多层生长，其中可能掺杂其他细胞，但主要为系膜细胞。细胞进行传代，并冻存。20dBAA:原代分离的肾小球0d（200×）B：肾小球培养20d后的原代细胞（100×）图2-5原代肾小球培养的细胞Fig2-5cellsculturedbyprimaryglomerular3.3Nef、Iso对原代培养的细胞NADPH氧化酶活性的影响图2-620μmNef、Iso对原代肾脏细胞NADPH氧化酶活性的影响Fig2-6Effectsof20umNef,IsoonNADPHoxidaseactivityofcellsculturedbyprimaryglomerular注：A:BlankB:HGC:NefD：IsoE:Apo，以上图片均为100×拍摄33 第二部分Neferine、Isoliensinine对肾小球及肾脏原代细胞NADPH氧化酶活性的影响由图2-6可知，Blank荧光强度很弱；HG组荧光强度最强，细胞内的ROS量较多，NADPH氧化酶活性较强；Apocynin组能较明显抵抑制细胞内ROS的产生，Nef、Iso也能抑制细胞内ROS的产生，但作用相比Apocynin较弱。4.讨论及结论糖尿病肾病的特点是肾功能丧失，病理学特点是肾小球血流量、滤过率增加，肾小球增大，基底膜增厚，ECM过度累积，肾小球硬化，和纤维化瘢痕形成，ROS的增加与DN的进程相关，ROS包括O2-、OH、H2O2、HClO，其通过间接或直接作用在生物大分子，如：RNA、DNA、脂质等，导致机体损伤。在高血糖、高血脂、血管紧张素Ⅱ等细胞因子的作用下，NADPH氧化酶激活，发生呼吸链级联反应，产生过量的ROS，增加TGF-β和纤维蛋白的表达，促进糖尿病肾病的发生发展。越来越多的研究显示，调节NADPH氧化酶的活性，特别是选择性抑制NADPH氧化酶亚基以减弱肾脏的氧化应，已成为延缓肾功能损害的有效治疗措施。NADPH氧化酶由5个亚基组成：2个膜亚基gp91phox、p22phox组成膜复合体b558，3个胞质亚基p47phox、p40phox、p67phox，其中gp91phox存在多样性，NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2统称NOX家族，NOX2主要在系膜细胞、足细胞、内皮细胞表达，在肾小球、进曲小管、远端集合管以NOX4为主，糖尿病时，各种刺激激活NADPH氧化酶，及DAG敏感的Ca信号通路，产生大量的ROS，促进糖尿病肾病的发生发展。莲子心提取物为多种成分的混合物，在本实验室前期的研究中表明莲子心提取物能抑制NADPH氧化酶活性，减少NADPH亚基p22phox、p67phox的表达，Nef、Iso是莲子心中的主要生物碱，具文献报道其具有抗氧化应激，清除自由基的作用。在本研究中采用5、10、20、40μmol的Nef、Iso对原代分离肾小球NADPH氧化酶的作用，用Apocynin做阳性对照，分别作用1h、12h，作用1h后，发现5、20μmol的Nef能抑制HG刺激下肾小球的NADPH氧化酶活性，与CN组比较，差异具有统计学意义，5、10、40μmolIso处理1h后，能减弱HG刺激的肾小球的NADPH氧化酶活性，与CN组比较，差异34 成都医学院硕士学位论文具有统计学意义，但作用12h后，差异没有统计学意义，其具体原因还有待研究。肾小球由3种固有细胞组成：内皮细胞、上皮细胞和系膜细胞。原代培养肾小球4-5d严格不动培养瓶，方便肾小球贴壁，7-10d左右，内皮细胞最先从肾小球长出，内皮细胞呈多边形，鹅卵石外形，进一步进行培养，2w左右，得到混合细胞，随着培养时间的延长，由于存在生长抑制现象，系膜细胞生长速度超过内皮细胞，内皮细胞逐渐死亡，得到系膜细胞，据文献报道，MCs在HG条件下产生的ROS可被过氧化氢酶或NADPH氧化酶抑制剂Apocynin抑制，Apocynin能通过抑制p47phox与胞膜结合而抑制NADPH氧化酶，故采用Apocynin作对照。本研究中采用原代培养的细胞，由于原代培养的细胞没有经过纯化，还可清除可能还存在其他杂细胞，研究20μmol的Nef、Iso对HG处理的原代细胞的NADPH氧化酶活性的影响，用CM-H2DCFDA检测其活性，HG组NADPH氧化酶活性明显增强，所产生的荧光强度也最强，与文献报道的一致。Nef、Iso对HG处理的系膜细胞的NADPH氧化酶活性有抑制作用，但抑制作用与Apocynin相比较弱。本研究再次证实Nef、Iso是莲子心中的活性成分，其能抑制高糖刺激下NADPH氧化酶活性的增强，可能是莲子心提取物发挥肾脏保护作用的重要成分。莲子心提取物中的主要成分除Nef、Iso等生物碱成分外，还包括莲心碱、木犀草素、芦丁等黄酮类化合物，除此以外，莲子心中还富含多糖类成分。近年来的研究主要集中在莲子心粗提物的的抗氧化及清除自由基能力上，莲子心的水提取液和醇提取液对超氧阴离子和羟自由基表现出良好的的清除能力，而本研究中主要考察了Nef、Iso是否能抑制引起氧化应激的NADPH氧化酶，至于其他的成分是否具有抑制活性还需进一步研究。35 参考文献参考文献[1]常洁,姜宗培,余学清.氧化应激及其在糖尿病肾病中的作用[J].国际内科学杂志,2007,34(02):105-08.[2]SedeekM,CalleraG,MontezanoA.CriticalroleofNox4-basedNADPHoxidaseinglucose-inducedoxidativestressinthekidney:implicationsintype2diabeticnephropathy[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2010,299(6):F1348-58.[3]NlanduKS,DizinE,SossauerG.NADPH-oxidase4protectsagainstkidneyfibrosisduringchronicrenalinjury[J].JAmSocNephrol,2012,23(12):1967-76.[4]何锦婷,虞舜.莲子心的现代临床应用[J].长春中医药大学学报,2012,28(03):544-46.[5]董兰,郑申声,陈昌国.莲心总碱的提取分离及其抗氧化性研究[J].食品工业科技,2011,5(07):329-31.[6]FonsecaVA.Rationalefortheuseofinsulinsensitizerstopreventcardiovasculareventsintype2diabetesmellitus[J].AmJMed,2007,120(9Suppl2):S18-25.[7]MasonRM,WahabNA.Extracellularmatrixmetabolismindiabeticnephropathy[J].JAmSocNephrol,2003,14(5):1358-73.[8]李金荣,王瑞英,张松筠.NADPH氧化酶在糖尿病肾病中的作用[J].国际内科学杂志,2009,36(02):93-97.[9]BrownleeM.Biochemistryandmolecularcellbiologyofdiabeticcomplications[J].Nature,2001,414(6865):813-20.[10]杜爱民,袁莉.NADPH氧化酶、氧化应激和糖尿病[J].国外医学(老年医学分册),2007,28(05):225-28.[11]TojoA,AsabaK,OnozatoML.SuppressingrenalNADPHoxidasetotreatdiabeticnephropathy[J].ExpertOpinTherTargets,2007,11(8):1011-18.[12]HeumullerS,WindS,Barbosa-SicardE.ApocyninisnotaninhibitorofvascularNADPHoxidasesbutanantioxidant[J].Hypertension,2008,51(2):211-17.[13]SarnaLK,WuN,HwangSY.BerberineinhibitsNADPHoxidasemediatedsuperoxideanionproductioninmacrophages[J].CanJPhysiolPharmacol,2010,88(3):369-78.[14]HeoSK,YunHJ,NohEK.EmodinandrheininhibitLIGHT-inducedmonocytesmigrationbyblockingofROSproduction[J].VasculPharmacol,2010,53(1-2):28-37.[15]GundimedaU,McNeillTH,ElhianiAA.Greenteapolyphenolspreconditionagainstcelldeathinducedbyoxygen-glucosedeprivationviastimulationoflamininreceptor,generation36 成都医学院硕士学位论文ofreactiveoxygenspecies,andactivationofproteinkinaseCepsilon[J].JBiolChem,2012,287(41):34694-708.[16]WiniarskaK,GrabowskiM,RogackiMK.InhibitionofrenalgluconeogenesiscontributestohypoglycaemicactionofNADPHoxidaseinhibitor,apocynin[J].ChemBiolInteract,2011,189(1-2):119-26.[17]PerssonP,HansellP,PalmF.NADPHoxidaseinhibitionreducestubularsodiumtransportandimproveskidneyoxygenationindiabetes[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2012,302(12):R1443-49.[18]AhmadA,MondelloS,DiPaolaR.Protectiveeffectofapocynin,aNADPH-oxidaseinhibitor,againstcontrast-inducednephropathyinthediabeticrats:acomparisonwithn-acetylcysteine[J].EurJPharmacol,2012,674(2-3):397-406.[19]HuC,CongXD,DaiDZ.ArgireinalleviatesdiabeticnephropathythroughattenuatingNADPHoxidase,Cx43,andPERKinrenaltissue[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol,2011,383(3):309-19.[20]WinglerK,HermansJJ,SchiffersP.NOX1,2,4,5:countingoutoxidativestress[J].BrJPharmacol,2011,164(3):866-83.[21]LiuGC,FangF,ZhouJ.Deletionofp47phoxattenuatestheprogressionofdiabeticnephropathyandreducestheseverityofdiabetesintheAkitamouse[J].Diabetologia,2012,55(9):2522-32.[22]PerssonP,HansellP,PalmF.NADPHoxidaseinhibitionreducestubularsodiumtransportandimproveskidneyoxygenationindiabetes[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2012,302(12):R1443-49.[23]刘双梅,李桂林,汤晓丽.甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠作用的代谢组学研究[J].中国药理学通报,2012,28(04):490-95.[24]XieY,ZhangY,ZhangLT.ProtectiveeffectsofalkaloidcompoundsfromNelumbinisPlumulaontert-butylhydroperoxide-inducedoxidativestress[J].Molecules,2013,18(9):10285-300.[25]王辉,杨淑青,李华.异莲心碱对氧化损伤红细胞的保护作用[J].医药导报,2005,24(11):992-94.[26]徐俊英,彭佳林,王嘉陵.异莲心碱对实验性脑缺血损伤的保护作用[J].中国医院药学杂志,2005,25(11):1026-29.[27]曾玉,邓红,周晓军.大鼠肾小球内皮细胞分离培养和鉴定[J].中华病理学杂志,37 参考文献2005,34(04):233-34.[28]WindS,BeuerleinK,EuckerT.ComparativepharmacologyofchemicallydistinctNADPHoxidaseinhibitors[J].BrJPharmacol,2010,161(4):885-98.[29]BasuroyS,BhattacharyaS,LefflerCW.Nox4NADPHoxidasemediatesoxidativestressandapoptosiscausedbyTNF-alphaincerebralvascularendothelialcells[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2009,296(3):C422-32.[30]WangZ,NiJ,ShaoD.Elevatedtranscriptionalco-activatorp102mediatesangiotensinIItype1receptorup-regulationandextracellularmatrixoverproductioninthehighglucose-treatedratglomerularmesangialcellsandisolatedglomeruli[J].EurJPharmacol,2013,702(1-3):208-17.38 成都医学院硕士学位论文文献综述NADPH氧化酶研究进展摘要：NADPH氧化酶是一类以胞质NADPH为电子供体，催化胞外的O2生成超氧阴离子的氧化还原酶，由gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、p40phox和Rac六种亚基组成。本文讨论了NADPH氧化酶结构及NADPH氧化酶激活的途径，在此基础上，本文还详细阐述了NADPH酶在糖尿病肾病中的作用及其相关检测方法。关键词NADPH氧化酶；氧化应激；超氧阴离子；检测方法AbstractNADPHOXIDASEisatypeofcytoplasmic,takeNADPHaselectrondonor,catalyticextracellularO2generatingsuperoxideionoxidoreductase,andcomprisesixtypesofsubunits,ie,gp91phox,p22phox,p47phox,p67phox,p40phoxandRac.ThisarticlediscussesthestructureofNADPHOXIDASEandactivationofNADPHOXIDASEpathway.Onthisbasis,Thispaperalsoelaboratesonit,sroleindiabeticnephropathyandthedetectionmethods.KeywordsNADPHoxidase;oxidativestress;Superoxideanion;detectionmethod.NADPH氧化酶是与胞浆膜相关的酶，主要分布在胚层来源的细胞中。NADPH氧化酶是以胞质NADPH为电子供体，催化胞外的O2生成超氧阴离子（O2-）的氧化还原酶。NADPH氧化酶最早在吞噬细胞中发现，是一种多酶复合物，位于吞噬细胞质膜上，由gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、p40phox[1]和Rac六种亚基组成，并带有细胞色素C和FDA。相比嗜中性粒细胞而言，其他组织中的NADPH氧化酶活性较低，分布也较广，结构也稍微有点不同，其主要功能是向氧化剂提供相应的信号。NADPH氧化酶是第二信使的主要来源。非吞噬型细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球系膜细、小管细胞具有类似于吞噬细胞型的NADPH氧化酶。非吞噬细胞上生成的ROS大部分在细胞内形成，由NADPH氧化酶生成的39 综述低量活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)可作为第二信使影响氧化还原敏感信号通路。另一方面，当NADPH氧化酶的活性上调时，大量生成的ROS也促进氧化应激的形成。动物模型和人体研究发现，在缺血再灌注损伤、炎症、高血压、糖尿病和动脉硬化等疾病中，NADPH氧化酶是ROS生成的主要[2-4]来源。其中，在由高血压和糖尿病肾病引起的肾脏疾病模型中，发现NADPH氧化酶介导ROS大量生成的证据，抑制NADPH氧化酶的表达和活性可减轻肾[5]脏的损伤。氧化应激在最新的研究中被发现广泛参与糖尿病肾病的发生发展，其中通过NADPH氧化酶产生的ROS在氧化应激中起着很重要的作用，但通过单纯的抗氧化治疗对相关疾病治疗效果不是很明显，然而通过抑制NADPH氧化酶，能显现出较好的治疗效果。鉴于对NADPH氧化酶的深入研究有助于指导其介导的疾病的治疗及药物开发，本文就NADPH氧化酶的结构、信号调节、及其检测方法的研究进展等关键问题进行了系统的分析和综述。1.NADPH氧化酶的结构及信号调节1.1NADPH氧化酶结构嗜中性粒细胞NADPH氧化酶主要由两部分组成，NADPH氧化酶亚基由膜单位和胞浆内单位组成，胞膜含有p22phox，gp91phox，两者共同组成了细胞色素b558，胞浆由p40phox、p47phox、p67phox和rac蛋白组成。静息状态下，NADPH氧化酶无活性，p40phox、p47phox和p67phox作为一个复合体存在于细胞质中；p22phox和gp91phox以异二聚体形式存在于细胞膜中（图Ⅰ）。在受到刺激的情况下，NADPH氧化酶通过其胞质成分p47phox的磷酸化与p67phox的移位，再与胞膜成分gp91phox和p22phox聚集而活化，以NADPH作为电子供体，将O2催化为O2-。40 成都医学院硕士学位论文图ⅠNADPH氧化酶的结构FigⅠstructureoftheNADPHOXIDASE催化亚基gp91phox为大分子的糖蛋白，含有辅基FDA和血红素，其具有核黄素和血红素结合区域，用于电子的转移，用NADPH作为电子供体产生O2-[6]可被黄素蛋白制剂diphenyleneiodonium抑制；gp91phox有一些同系物，主要包括Nox和Duox1、Duox2。其中，Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5为65KD的中心蛋白，Duox1和Duox2是175到180KD的蛋白质。在激活过程中，P47phox主要负责将胞浆复合体转运至胞膜。P40phox是一个刺激亚基，通过激活p40phox可以激活NADPH氧化酶；通过抑制p40phox也可抑制氧化酶，表达p40phox的酶产生的O2-是不表达p40phox的一半，其对于氧化酶的激活[7]不是必须的，其具体功能还有待研究。rac1的调节作用对酶的活性也起着关键的作用，它转移到质膜上是激活NADPH氧化酶所必须的，Rac结合在p67phox后，在GTP结合部位激活NADPH氧化酶，在HepG2细胞中注入h-rac1可增强依赖NADPH氧化酶的ROS的产生，注入负性作用h-rac1抑制NADPH[8][9]氧化酶的活性。内皮细胞中，显负性的rac1可消除应激引起的依赖NADPH氧化酶的ROS的产生，人的内皮细胞对血管内皮生长因子的应答需要一定量水平的依赖NADPH氧化酶产生的ROS，其受rac1的调节。同样地，在Page[10]等人报道呼吸道平滑肌中PDGF诱导的细胞周期激活由NADPH氧化酶引起，可被显负性的rac1抑制。41 综述1.2NADPH氧化酶的信号调节机械应力、高血脂、高血糖、脂肪酸、激素、血管紧张素Ⅱ、生长因子、TNF-α等各种刺激可使NADPH氧化激活，产生活性氧，作为信号传递分子或自由基的来源导致氧化损伤（图Ⅱ）。图Ⅱ激活NADPH氧化酶的途径FigⅡpathwayofactivationofNADPHOXIDASE高糖刺激下血管紧张素Ⅱ、晚期糖基化终末产物与其受体结合激活蛋白激酶C，从而活化NADPH氧化酶亚基p47phox、p67phox生成ROS，NADPH氧化酶作为细胞第二信使活化转录因子NF-κB和AP-1，激活JAK信号通路，活化AKT、MAPK、ERK1/2等下游信号，促进细胞增殖、纤维化和炎症。在[37]DriendlingKK究中发现培养的血管平滑肌细胞(VSMC)发现血管紧张素Ⅱ[11]能增加NADH或者NADPH来源的O2-。在JaimesEA的研究中发现通过加入DPI可以抑制肾脏系膜细胞的ROS产生。凝血酶、血小板来源的生长因子（PDGF）、肿瘤坏死因子均能使得VMSC的NADPH氧化酶的活性升高，进而产[12-15]生大量的ROS。ROS引起蛋白巯基可逆的变化导致其构象发生改变，从而影响DNA的结合和酶的激活。当细胞受到生长因子或AngⅡ的刺激时，会激活很多细胞信号通路，包42 成都医学院硕士学位论文2+括PKC、MAPK、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine）、磷脂酶、Ca信号通路，其中，MAPK家族包含了调控细胞对生长、凋亡、及应答刺激信号的重要调节蛋白。在VSMC中，只有O2-激活p22/44MAPKs，才能使得H2O2和O2-[16][17]发挥促进细胞生长的作用。Kitada等研究发现，TGF-β可上调小鼠系膜细胞p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的表达以及小管上皮细胞p22phoxmRNA的表达；本研究还证明了可以通过PKC-β介导的NADPH氧化酶的活化来提高胞内ROS水平，而ROS又可提高PKC活性，共同构成了多[18]种疾病的重要信号通路。在TOYOSHI等人的研究中发现在糖尿病血管组织中，增加的ROS是通过PKC介导的，佐链脲霉素诱导的糖尿病肾病大鼠可明显显现出ROS的增加，PKC抑制剂CGP41251(50mg/kg)可显著抑制DM大鼠的ROS的增加。2.NADPH氧化酶与糖尿病肾病DN（Dabeticnephropathy，糖尿病肾病）是DM（diabetesmellitus，糖尿病）最常见最严重的微血管并发症之一，约有30%的1型DM和40%2型DM会并发DN。目前，中国患病人数居世界第二位，我国糖尿病患病人群中，2型糖尿病占90%以上，1型糖尿病约5%，城市妊娠糖尿病接近5%，其他类[19]型仅0.7%。在糖尿病肾病的各种发病机理中，氧化应激是其中一个比较重要的发病机理。NADPH氧化酶过度激活产生大量ROS，ROS通过氧化损伤功能性蛋白及相应的酶，过度激活PKC，参与胰岛素抵抗；高糖诱导ROS增多，ROS还可通过激活MAPK和JSK/STAT信号转导促进MCP-1，TGF-B1，PAI-1等炎症因子过度表达，促进细胞外基质增加和肾小管间质纤维化。过量的糖脂经线粒体氧化代谢，产生过量的超氧阴离子，激活PKC和NF-κB，产生超氧阴离子，其氧化NO产生氮过氧化物，损害血管内皮功能，促进糖尿病肾病的发生发展。非中性粒细胞NADPH氧化酶是探索DN发病机理的重要目标，抑制NADPH酶成为治疗DN的一个目标靶点。2.1天然药物抑制NADPH氧化酶，改善DN天然药物在DN的治疗方面，起着一定的作用。夹竹桃麻（Apocynin,Apo）43 综述能改善肾小球系膜扩张，能显著降低肾小球VEGF表达的光学密度，其通过免[21]疫组化染色鉴定，降低24h的尿8-OHDG和MDA浓度。Apo通过阻止p47phox和p67phox亚基和细胞膜上NADPH复合体组装进而抑制NADPH氧化酶，能够减弱肾脏细胞外基质累积所致的纤维。DM大鼠细胞膜gp91phox亚基的表达增加，这种作用可被apocynin抑制，apocynin可减少H2O2排泄，肾小球系[21,22]膜扩张，系膜表达纤维化因子和Ⅰ型胶原及足细胞p47phox的表达。槲皮素是一种天然黄酮化合物，以多苷形式在植物界分布广泛，在赖鹏斌等人[23]的研究中，槲皮素能降低肾重指数，减少糖尿病大鼠肾脏p47phox、NF-κb、FN、ColIV及ROS的表达，显示出其能减轻大鼠糖尿病肾病的作用。[24]PerolaD.B.等的研究表明GT（GreeenTea，绿茶）能够减弱高血压引起的氧化应激，减轻肾脏损伤。GT能改善大鼠蛋白尿和肾脏胶原蛋白Ⅵ的累积，并减少自发高血压（Spontaneoushypertension，SHR）大鼠的肾脏氧化应激，其机理主要通过下调NDPH氧化酶的Nox4的表达。2.2N-乙酰半胱氨酸对DN的改善作用N-乙酰半胱氨酸是一种含-SH的抗氧化剂，可改善心、肺、肾脏等的缺血-再灌注损伤的毒性作用，由于其含有-SH，具有清除自由基的能力。在Hsu[25]S-P等人的研究中，通过N-乙酰半胱氨酸治疗，可改善HD患者贫血症状和[26]减少血浆中的8-异前列腺素及氧化LDL水平。在郭志新等人的研究中，N-乙酰半胱氨酸能减少糖尿病大鼠UPro/24、血浆游离15-F2t-异前列烷水平、系膜基质增宽指数、降低肾脏p22phox、p67phox和CTGF蛋白的增高，显著降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平，减轻肾脏氧化应激对肾脏组织的损伤，产生肾脏保护作用。2.3阿司匹林（aspirin）对DM的治疗作用[27]Cangemi等人通过将T2DM病人随机分为治疗组（n=50）和非治疗组（n=50）及100个非DM病人，通过口服aspirin100mg/d治疗7d后，收集血小板和血小板异前列腺素，DM病人通过收集血小板和检测异前列腺素的水平发现存在Nox2的激活，Aspirin治疗后发现血小板血栓烷素（TXA2）被抑制，aspirin治疗后在非DM患者身上没有发现相关检测指标的改变。研究44 成都医学院硕士学位论文证实aspirin治疗DM患者中，氧化应激介导血小板异前列腺素的过度产生与增加的血小板聚集有关，其能减弱aspirin的TxA2抑制的作用，该药已经进入Ⅳ期研究，疗效较好。3.NADPH氧化酶的检测方法NADPH氧化酶的活性检测中，大部分研究通过运用能与ROS反应生成具有特殊性能的产物的探针来对其进行表征。ROS的测定主要包括分光光度法、化学发光法、荧光光度法、和电子自旋共振法。3.1电子自旋共振（Electronspinresonance，ESR）光谱检测ESR光谱法主要通过未配对的电子对其进行检测，由于O2-·的半衰期较短，在细胞中的浓度很低及检测方法灵敏度不够，故采用电子自旋捕捉剂如苯基叔丁基氮氧化合物PBN、1-氧基-4-吡啶基-N-叔丁基氮氧化合物POBN等对不稳定的自由基进行捕捉。在刘玲[28]等人的实验中，通过采用ESR光谱技术研究食品加工储藏中与氧化相关的自由基变化，其借助捕集剂能够检测出美拉德反应时及时出现的小分子不稳定自由基。虽然捕集剂能增强ESR信号，但其仍存在一些不利影响，如由于细胞环境有一定还原性，很多以硝基酮作为捕集剂的分子很快会转化为无ESR信号的分子，这会导致出现假阴性结果[29]。体内细胞和培养细胞中的ESR信号会通过酶代谢或Vc等物质还原，故细胞环境ESR信号实际只代表细胞外信号[30]。但在严格设有对照组的情况下，ESR光谱还是可以用来检测O2-·.和NOX活性的。3.2分光光度法细胞色素C还原法和NBT法是分光光度法常用的方法。该法是检测NADPH氧化酶活性使用最广泛的方法。由于细胞色素C具有比O2-·高的电子势能，O3+）将其转变为2-·.将其未配对的电子转移给高铁细胞色素C（Fe亚铁细胞色素C（Fe2+），导致其在550nm处的吸光度增加。然而由于存在很多分子和酶能还原高铁细胞色素C，吸光度的改变不能就说明是O2-·引起的。细胞色素C不能透过细胞膜，对于检测较低浓度的O2-·，该法不是很灵敏，主要用来检测细胞裂解物中NOX活性和吞噬细胞中NOX2。NBT可渗透细胞，进入细胞后，被O2-·通过两步反应还原，其中包括一步电子反45 综述++应和一步自由基中间体反应。NBT首先通过O2-·还原为NBT·，NBT·被歧++化或者通过再接收O2-·的一个电子形成稳定的NBTH，NBTH是一种蓝色结晶，可通过550nm的吸光度对其进行检测，大部分实验通过用DMSO溶解该结晶后，通过检测630nm处的吸光度对其进行检测。NBT法主要用来对CGD病人确诊。3.3化学发光法化学发光法是检测自由基较为灵敏的方法。目前为止，已经有很多化学发光探针用来检测NOX。其中光泽精和鲁米诺由于在一定条件下，ROS能与鲁米诺（Luminol)、光泽精（Lucigenin）及其类似物等发光试剂反应，产生不同强度、不同发射波长的化学光辐射。目前鲁米诺化学发光法用于精子与精液、血液与组织匀浆上清液、细胞[31]等样品中ROS检测，在李颖畅[32]等人的报道中用于检测蓝莓花色苷对氧自由基的清除作用。但.OH、O2-·、H2O2均能氧化鲁米诺产生化学发光，故不用来检测单一某种ROS。光泽精主要用于细胞外自由基的测定。这两种探针主要的区别是：（1）光泽精主要被O2-·还原为光泽精阳离子，而鲁米诺则是主要被氧化发光；（2）光泽精对O2-·有选择性而鲁米诺检测哪种ROS不是很明确；（3）光泽精不能渗透细胞而鲁米诺可渗透细胞，故可用来检测细胞内和细胞外自由基。除此以外，使用较多的如L-012，其为光泽精类似物，对于检测NOX活性，灵敏度是光泽精100倍左右，其用于检测体内依靠NOX2产生O[33]。2-·另一种使用较多的是MCLA，其对于O2-·具有敏感性和特异性，无自氧化作用，稳定性好，故其广泛用于检测肝脏、心脏、肺脏、和血管组织的ROS，但MCLA得使用需注意一个问题，过氧亚硝基阴离子（ONOO-）能诱导其发光，其还能发生自氧化导致较强的荧光背景，因此在实验中可考虑加入活性氮抑制剂，增加结果的准确性。3.4荧光光度法荧光光度法用合适的探针作用于细胞，与ROS反应后，探针的化学结构发生变化，生成具有强荧光的产物，通过检测反应产物的强度可反映ROS的水平。目前使用较多的是二氯荧光素（Dichlorodihydrofluorescein，DCFHDA）46 成都医学院硕士学位论文和氢化乙啡啶（Hydroethidine，HE）。DCFHDA主要用于检测ROS和H2O2，DCFHDA能被细胞吸收并水解为DCFH，DCFH不发荧光，细胞内的DCFH被H2O2氧化为具有较强荧光的DCF，其激发波长为498nm，发射波长是525nm。ZhenWang等人的研究中用此方法检测高糖处理的大鼠肾小球和肾脏系膜细胞的NADPH氧化酶活性的变化[34]。通过对其标准操作进行稍微修改，DCFHDA可用来低定量检测nanoparticles（NPS）诱导的细胞氧化应激，通过将细胞与2mMDCFHDA孵育20min，用流式细胞仪检测细胞内的DCF含量，用来间接表示NADPH氧化酶活性[35]。对于DCFHDA的使用需注意：（1）其除了能被H[33,36]也能氧化DCFH为DCF；2O2氧化外，ONOO-和HOCl（2）DCF的反应会产生中间自由基，其很快与O2反应产生O2-·.并生成H2O2，这种氧化还原循环会导致DCF荧光信号的放大。由于DCF及其荧光分子不具选择性，其还能被.OH、ROOH、NO.等多种ROS氧化，实验所得结果不能简单当成H2O2或者NOX活性，还需相关的控制条件或者使用特定的NOX抑制剂进行辅助判断。HE是一种亲脂物质可穿过细胞膜，在细胞内，HE氧化为带正电的E+插入DNA，发出红色荧光，故把红色荧光产物(E+)作为细胞内O2-·.的标志物。Rothe等人用流式细胞仪通过检测细胞内的荧光强度来表示细胞内NADPH氧化酶的活性，在马晓东等人的研究中，发现使用激光共聚焦显微镜结合HE荧光标记技术可原位实现观察活细胞内NADPH氧化酶活性的变[37]等人证实了2-OH-E+而不是E+是O化。后来，kalyanaraman2-·.与HE的反应产物，形成速率为2.6±0.6×105m-1s-1，激发波长为520nm，发射波长为610nm，用于定量测定细胞内O2-·，但其准确度相对低。目前虽然有很多的方法、探针和技术用于检测NOX活性及来源于NOX的O2-·和H2O2，但所有方法都存在一定的局限性。因此探针的使用应考虑实验的要求如对某种物质的选择性、灵敏度、分析的对象以及实验结果定量或定性，故在选择探针时，可从以下几方面考虑：1.所使用的探针的化学结构及性质如是否需要加入辣根过氧化物等催化剂，探针本身是否会发生自氧化；2.方法的特异性，即所选用的探针是否对H2O2或O2-·具有选择性，如果没有，47 综述是否可能会存在干扰；3.组织或细胞是否会吸收探针；4.所测的实验材料（血清、细胞、组织）中的ROS含量是否与所测信号成线性关系；5.明确所分析的细胞或组织中表达哪种NOX或是NOX的哪种亚型；6.可同时使用几种探针来共同测定NOX来源的O2-·或H2O2；7.对于NOX是否参与ROS的产生，可考虑加入NOX特异性抑制剂如DPI，如果仍有ROS产生，可判断ROS不是来源于NOX。4.展望自从60年代NADPH氧化酶的发现，我们对该酶的研究已经取得了很大的进展。我们对NADPH氧化酶的结构功能已经有了较清楚的认识，其激活途径也能较好的阐明。今年的研究发现NADPH氧化酶所介导的氧化应激在糖尿病肾病中起着很重要的作用，抑制NADPH氧化酶是治疗糖尿病肾病的新靶点。目前，很多天然药物在抑制NADPH氧化酶的研究应用中取得了一定的进步，但大多数缺乏特异性，存在一定的副作用，对NADPH氧化酶特定亚基的抑制可能成为将来研究的新方向。对于NADPH氧化酶活性的检测，本文提供了一些目前较常用的方法，分析比较了各方法的选择性、灵敏度、适用性及优缺点，帮助研究者在做相关实验时，能做出较好的选择，但在实验过程中应该严格设置对照实验或者使用NADPH氧化酶抑制剂做对照。参考文献[1]BERNARDM.BABIOR.NADPHOxidase:AnUpdate[J].Blood,1999,8(93):1464-1476.[2]郑建普，孙莉.NADPH氧化酶对自发性高血压大鼠体内氧化应激的影响[J].中国药理学通报,2006,22(9):1079-1083.[3]刘永娟，隋鹏诺，夏研.NADPH氧化酶与动脉硬化[J].长沙医学院学报，2013，2(11):42-44.[4]常连胜，冯涛，郭应禄.结石病人尿骨桥蛋白测定的临床意义[J].中华泌尿外科杂志,2000,21(12):709-711.[5]ASABAK,TOJOA,ONOZATOML,etal.EffectsofNADPHoxidaseinhibitorindiabeticnephropathy[J].KidneyInt,2005,9(67):1890-1898.[6]JVET.Expressionandcharacterizationoftheflavoproteindomainofgp91PHOX[J]Sci,2000,5（1）:19-26.48 成都医学院硕士学位论文[7]BENDALLJK,CAVEAC,HEYMESC,GALLN,SHAHAM:Pivotalroleofagp91phox-containingNADPHoxidaseinangiotensinII-inducedcardiachypertrophyinmice[J].Circulation,2002,8（105）:293-296.[8]COOLRH,MERTENE,THEISSC,ACKERetal.Rac1,andnotRac2,isinvolvedintheregulationoftheintracellularhydrogenperoxidelevelinHepG2cells[J].BiochemJ,2011,6(5):365-373.[9]CAIZ,CHENH,TaoJ,etal.AssociationofbaseexcisionrepairgenepolymorphismswithESRDriskinaChinesepopulation.OxidativeMedicineandCellular[J]Longevity,2012,12(5):811-816.[10]CRAWFORDA,FASSETTRG,COOMBESJS,etal.Glutathioneperoxidase,superoxidedismutaseandcatalasegenotypesandactivitiesandtheprogressionofchronickidneydisease[J].NephrologyanalysisTransplantation,2011,13(9):2806–2813.[11]JAIMESEA,GALCERANJM,RAIJL.AngiotensinIIinducessuperoxideanionproductionbymesangialcells[J].KidneyInt.1998,4(54):775–784.[12]KEULENAERGW,ALEXANDERRW,USHIO-FUKAIM..Tumornecrosisfactor-aactivatesap22phox-basedNADHoxidaseinvascularsmoothmusclecells[J].BiochemJ.1998,3(329):653–657.[13]PATTERSONC,RUEFJ,MADAMANCHINR,BARRY-LANEP.StimulationofavascularsmoothmusclecellNAD(P)Hoxidasebythrombin:evidencethatp47(phox)mayparticipateinformingthisoxidaseinvitroandinvivo[J].JBiolChem,1999,3(274):19814–19822.[14]MARUMOT,SCHINI-KERTHVB,FISSLTHALERB.Platelet-derivedgrowthfactorstimulatedsuperoxideanionproductionmodulatesactivationoftranscriptionfactorNF-kappaBandexpressionofmonocytechemoattractantprotein-1inhumanaorticsmoothmusclecells[J].Circulation,1999,18(96):2361–2367.[15]SUNDARESANM,Zu-XiY,FERRANSVJ.RequirementforgenerationofH2O2forplatelet-derivedgrowthfactorsignaltransduction[J].Science,1995,13(270):296–299.[16]BAASAS,BERKBC.Differentialactivationofmitogen-activatedproteinkinasesbyH2O2andO2-invascularsmoothmusclecells[J].CircRes,1995,5(77):29–36.[17]KITADAM,KOYAD,etal.Translocationofglomerularp47phoxandp67phoxbyproteinkinaseC-βactivationisrequiredforoxidativestressindiabeticnephropathy[J].Diabetes,2003,21(10):2603-2614.49 综述[18]TOYOSHIINOGUCHI,TOSHIYOSONTA.ProteinKinaseC-DependentIncreaseinReactiveOxygenSpecies(ROS)ProductioninVascularTissuesofDiabetes:RoleofVascularNADPHOxidase[J].JAmSocNephrol,2003,14(14):S227-S232.[19]代庆红,王忠东.中国糖尿病的现状调查[J].中国医药指南,2011,9（13）：206-208.[20]魏潇凡.晚期氧化蛋白产物通过NADPH氧化酶刺激介导大鼠系膜细胞过度表达细胞外基质[D].[21]AHMADA,MONDELLOS,DIPAOLAR,etal.Protectiveeffectofapocynin,aNADPH-oxidaseinhibitor,againstcontrast-inducednephropathyinthediabeticrats:Acomparisonwithn-acetylcysteine[J].EuropeanJournalofPharmacology,2012,5(23):397-406.[22]WINIARSKAK,GRABOWSKIM,ROGACKIMK,etal.InhibitionofrenalgluconeogenesiscontributestohypoglycaemicactionofNADPHoxidaseinhibitor,apocynin[J].Chemico-biologicalinteractions,2011,189(12):119-126.[23]赖鹏斌，张蕾，等.槲皮素对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶p47phox亚基表达的影响[J].福建医科大学学报,2012,6（3）:161-164.[24]PEROLADB.RIBALDO,DeniseS.SOUZAetal.Greentea(Camelliasinensis)AttenuatesNephropathybyDownreagulationNOX4NADPHOxidaseinDiabeticSpontaneouslyHypertensiveRats[J].TheJournalofNutrition,2009,16(139):95-100[25]HSUS-P,CHIANgGCK,YANGSY.N-acetylcysteineforthemanagementofanemiaandoxidativestressinhemodialysispatients[J].Nephron,2010,116(3):c207–c216.[26]郭志新,JOHNHM.N-乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶表达的影响[J].中国糖尿病杂志,2008,11（9）：544-553[27]CANGEMIR,PIGNATELLIP,CARNEVALER.Plateletisoprostaneoverproductionindiabeticpatientstreatedwithaspirin[J].Diabetes,2012,11(61):1626-32.[28]刘玲，纪淑娟，檀德宏，等.利用电子自旋共振技术研究美拉德反应自由基变化[J].农业工程学报，2013，29(06)：280-86.[29]DikalovS，GriendlingKK，HarrisonDG.Measurementofreactiveoxygenspeciesincardiovascularstudies[J].Hypertension，2007，49(4):717-27.[30]WittingPK，RaynerBS，WuBJ，etal.Hydrogenperoxidepromotesendothelialdysfunctionbystimulatingmultiplesourcesofsuperoxideanionradicalproductionanddecreasingnitricoxidebioavailability[J].CellPhysiolBiochem，2007，20(5):255-68.[31]WardmanP.Fluorescentandluminescentprobesformeasurementofoxidativeand50 成都医学院硕士学位论文nitrosativespeciesincellsandtissues:progress,pitfalls,andprospects[J].FreeRadicBiolMed，2007，43(7):995-1022.[32]李颖畅，孟宪军，修英涛，等.化学发光法测定蓝莓花色苷对氧自由基的清除作用[J].食品研究与开发，2008，29(03):72-75.[33]DaiberA，AugustM，BaldusS，etal.MeasurementofNAD(P)Hoxidase-derivedsuperoxidewiththeluminolanalogueL-012[J].FreeRadicBiolMed，2004，36(1):101-11.[34]WangZ，NiJ，ShaoD，etal.Elevatedtranscriptionalco-activatorp102mediatesangiotensinIItype1receptorup-regulationandextracellularmatrixoverproductioninthehighglucose-treatedratglomerularmesangialcellsandisolatedglomeruli[J].EurJPharmacol，2013，702(13):208-17.[35]ArandaA，SequedoL，TolosaL，etal.Dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate(DCFH-DA)assay:aquantitativemethodforoxidativestressassessmentofnanoparticle-treatedcells[J].ToxicolInVitro，2013，27(2):954-63.[36]WhitemanM，RoseP，SiauJL，etal.Hypochlorousacid-mediatedmitochondrialdysfunctionandapoptosisinhumanhepatomaHepG2andhumanfetallivercells:roleofmitochondrialpermeabilitytransition[J].FreeRadicBiolMed，2005，38(12):1571-84.[37]ZhaoH，JosephJ，FalesHM，etal.DetectionandcharacterizationoftheproductofhydroethidineandintracellularsuperoxidebyHPLCandlimitationsoffluorescence[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(16):5727-32.51 附录附录缩略语全称(英文全称中文全称)缩写英文名称中文名称ROSRactiveOxidativeStress氧化应激O2-superoxide超氧化物OH-hydroxylradical羟自由基NADPHnicotinamideadeninedinucleotidephosphate还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸，-，Apocynin4hydroxy-3-methoxyacetophenoe夹竹桃麻素SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶BUNbloodureanitrogen尿素氮DMdiabetesmellitus糖尿病UAlburinaryalbumin尿白蛋白Ucrurinarycreatinine尿肌酐Nefneferine甲基莲心碱Isoisoliensinine异莲心碱DNdiabeticnephropathy糖尿病肾病STZstreptozotocin链脲佐菌素GBMTglomerularbasementmembranethickness肾小球基底膜厚度52 成都的医学院硕士论文对照组模型组莲子心低剂量组(20mg/kg)莲子心中剂量组(50mg/kg)莲子心高剂量组(200mg/kg)卡托普利组（10mg/kg）附图1各组大鼠肾脏组织HE染色的结果（100×）Fig1TheresultofratskidneytissueHEstaining（100×）53 附录附图2各组大鼠肾脏组织电镜结果(12000×）Fig2HistopathologyinRatswithelectronmicroscope（12000×)54 成都的医学院硕士论文致谢研究生的生活紧张艰苦而又充实，转眼三年研究生生涯即将结束，这三年里有成功，有失败，有欢笑，有泪水，但不变的是成长。首先要感谢的是我的导师，马松涛教授，本文能顺利完成，离不开老师的悉心指导和严格要求，他科研过程中的严谨思维、坚持不懈的精神深深鼓舞着我，让我在最困难的时候依然坚持走下去，除此以外，他也教会了我很多做人的道理，他严谨的治学态度和求实的科研作风深深影响了我，这些都将使我终身受益。还要感谢学校其他老师给予过我指导和帮助老师：颜晓燕老师、许小红老师、张仲林老师、廖昌军老师、刘冬恋老师、李敏慧老师、阳泰老师等。师恩似海，衷心祝福各位老师工作顺利，身体健康！衷心感谢实验室的师兄、师姐及同窗同学给予我的关心和帮助：刘进师兄、罗兴燕师姐、曾典、戢太阳、周涛、练湘红等，在我失意的时候开解我，并在实验和论文完成过程中提供给我无私帮助！最后感谢我的父母，是他们含辛茹苦把我养大，让我有机会进入研究生阶段的学习，感谢他们在在我求学道路上给我无私的帮助和鼓舞，让我在这条道路上不感到孤单！55