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时间:2019-03-12
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1、学位论文三物白散干预恶性腹水研究StudyonInterventionofMalignantAsciteswithSanwubaiPowder龙柳伊指导教师姓名:由凤鸣教授申请学位级别:硕士专业名称:中医内科学论文提交时间:2018.03论文答辩时间:2018.05二○一八年五月成都中医药大学硕士学位论文中文摘要【目的】本研究选择肝癌H22恶性腹水模型为研究对象,观察三物白散对小鼠恶性腹水中H22细胞的生存率、细胞凋亡、细胞周期、Bcl-2蛋白表达情况的影响,从而观察三物白散干预小鼠肝癌H22细胞恶性腹水的效果,并初步探讨其作用机
2、制。【方法】1.H22腹水瘤小鼠模型的建立:于小鼠的右下腹部腹腔注射0.1mL肝癌H22腹水瘤细胞悬液(含H22腹水瘤细胞1×106个),观察小鼠的一般情况、体重增长情况、腹部增大情况,当腹部明显变大时,实验者用手指轻轻晃动小鼠腹部,能够感觉的细微波动感即为造模成功。2.三物白散干预恶性腹水研究:将造模成功的60只KM小鼠在造模48h后,随机分为5个组分别为模型组、阳性组、三物白散高剂量组、三物白散中剂量组、三物白散低剂量组,每组12只。分组后开始药物干预,连续用药干预7天,末次给药之后称取体重,用随机麻醉处死每组小鼠半数(每组6
3、只),无菌条件下开腹取腹水,测量腹水量及用台盼蓝计数方法测量H22肝癌细胞数量。绘制小鼠体重变化曲线、腹水形成箱状图,计算H22肝癌细胞生存率。每组余下的6只小鼠继续饲养直至死亡,记录生存期并绘制生存期箱状图。3.三物白散干预恶性腹水与细胞凋亡、周期及bcl-2蛋白表达的关系:取小鼠腹水FCM法检测细胞周期、细胞凋亡,WB法检测bcl-2蛋白表达情况。【结果】1.造模成功,腹水形成率100%。模型组接种H22细胞3-4天后,可以观察到小鼠腹部逐渐隆起,7-8天后小鼠腹部明显隆起增大,实验者用手指轻轻晃动小鼠腹部,能够感觉的细微波动
4、感,说明模型组小鼠恶性腹水已经生成。小鼠体重变化:从第4天开始,小鼠体重有明显增长趋势。而空白组小鼠腹部无明显变化,且体重呈缓慢增长趋势。2.与模型组比较,阳性组小鼠和三物白散高剂量小鼠生存期明显延长,差I成都中医药大学硕士学位论文异极显著(P<0.01);中剂量组小鼠生存期延长,差异显著(P<0.05)。而三物白散低剂量小鼠的生存期明显低于阳性组,差异极显著(P<0.01)用台盼蓝拒染法检测各组小鼠腹水中肿瘤活细胞及总细胞数,得出腹水肿瘤细胞生存率。模型组、阳性组、三物白散高剂量组、中剂量组、低剂量组各组小鼠腹水肿瘤细胞分别为(
5、54.49±3.81)%、(31.98±1.62)%、(43.18±3.06)%、(43.21±1.91)%、(48.73±2.08)%。与模型组相比较,阳性组、三物白散高剂量组、中剂量组小鼠腹水中的肿瘤细胞生存率明显降低,差异极显著(P<0.01)。3.三物白散高、中、低剂量组小鼠腹水H22细胞处于G0/G1期百分比例分别为(48.76±1.07)、(43.11±1.15)、(34.84±1.83),很明显高于模型组(26.90±1.43),差异极显著(P<0.01);三物白散高剂量组小鼠腹水H22细胞处于S期百分比例分别为:(
6、47.33±1.23),高于模型组(54.48±2.11),差异显著(P<0.05);三物白散高、中、低剂量组小鼠腹水H22细胞处于G2/M期百分比例分别为:(15.03±0.85)、(6.23±0.72)、(12.39±1.33),明显低于模型组(18.62±0.71),差异极显著(P<0.01)。结果提示,三物白散作用于小鼠腹水中H22细胞主要是将H22细胞周期阻滞于G0/G1期和S期,进而减少G2/M期的细胞比例。细胞凋亡:模型组、阳性组、三物白散高、中、低剂量组的早期凋亡率分别为:(0.60±0.14)、(13.47±0.
7、77)、(1.35±0.09)、(1.17±0.12)、(0.93±0.05);模型组、阳性组、三物白散高、中、低剂量组的晚期凋亡率分别为:(0.66±0.06)、(7.11±0.51)、(1.95±0.30)、(1.87±0.32)、(1.33±0.39)。早期凋亡率:与模型组比较,阳性组差异极显著(P<0.01),三物白散高、中剂量组差异显著(P<0.05),三物白散低剂量组差异无统计学意义(P>0.05);与阳性组比较,三物白散高、中、低剂量组均异极显著(P<0.01)。晚期凋亡率:与模型组比较,阳性组差异极显著(P<0.0
8、1),三物白散高、中剂量组差异显著(P<0.05),三物白散低剂量组差异无统计学意义(P>0.05);与阳性组比较,三物白散高、中、低剂量组均异极显著(P<0.01)。Bcl-2蛋白相对表达量:阳性组小鼠腹水H22细胞Bcl-2蛋白相对表达量为:(
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