CEP250基因突变引起视网膜色素变性的致病机理研究

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1、分类号：R77单位代码：10343学号：151003595硕士学位论文论文题目:CEP250基因突变引起视网膜色素变性的致病机理研究研究生姓名房小龙学科专业眼科学类型学术型指导教师金子兵二O一八年五月论文题目:CEP250基因突变引起视网膜色素变性的致病机理研究答辩委员会主席：刘春巧教授（中山大学）答辩委员会成员：池在龙研究员（温州医科大学）侯方研究员（温州医科大学）论文答辩日期：2018年5月21日温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要--------------------------------------------------4英文摘要------

2、--------------------------------------------7前言-----------------------------------------------------10材料与方法-----------------------------------------------11结果-----------------------------------------------------28分析与讨论-----------------------------------------------34参考文献----------

3、---------------------------------------35致谢-----------------------------------------------------37综述-----------------------------------------------------39学位论文独创性声明---------------------------------------493温州医科大学硕士学位论文中文摘要CEP250基因突变引起视网膜色素变性的致病机理研究目的视网膜色素变性（retinitispigmentosa，RP）

4、是一组由于基因变异引起视网膜光感受器细胞变性凋亡的遗传性眼病。该病以视力下降、视野缩窄、夜盲、眼底色素沉着以及视网膜电图（ERG）异常为主要临床特点，是一种眼科常见的遗传性视网膜疾病，具有明显的家族遗传倾向。近年的国内流行病学调查研究显示我国的RP发病率约为1/3784，高于世界平均水平，据此保守估计全国约有50-70万患者。迄今为止已发现70多个与该病相关的致病基因，但由于对大多数基因变异的致病机制不甚明了，所以目前尚无十分有效的治疗方法。本研究基于前人在RP遗传病因和致病机理方面的大量研究基础，通过全外显子测序在一个RP家系中初步发现了新型致病基因CE

5、P250，并首次构建与该家系中RP患者相同的CEP250无义突变的基因敲入小鼠模型，进而通过对小鼠模型视网膜形态结构以及功能等的研究，为以后该病发病机制的探索以及将来疾病的基因和干细胞治疗打下基础。方法1.新型RP致病基因的鉴定我们在前期临床门诊工作中发现了一个RP家系，先利用目标区域捕获测序技术对先证者进行了所有已知RP基因的突变筛查和分析，排除了该病例是由于已知基因突变引起的，从而提示存在新型RP致病基因的突变。然后采用全外显子测序技术对先证者及其父母进行了基因组编码区及剪切位置的筛查，并结合生物信息学分析、突变致病性分析以及Sanger测序验证，最终

6、发现了新型候选致病基因。2．小鼠模型的构建本研究利用TALEN基因编辑技术构建了Cep250基因敲入小鼠模型。主要步骤如下：首先将带有突变信息的基因片段转入小鼠胚胎干细胞中，待其增殖后用SouthernDNA印记法筛选出阳性的克隆细胞，再将阳性的克隆细胞通过显微注射法导入C57BL/6小鼠的囊胚中。通过这种方法我们可以得到Cep250杂合突变的小鼠，再将杂合小鼠进行交配，就获得了可用于实验的Cep250纯合突变小鼠。3．小鼠基因型鉴定剪取小鼠尾尖或脚趾组织并提取其DNA，然后在事先设计好的引物和4种脱4温州医科大学硕士学位论文氧核苷酸存在的条件下，依赖于D

7、NA聚合酶的酶促合反应将DNA目的片段扩增，最后通过电泳条带来鉴定小鼠基因型。PCR主要分为如下5个步骤：预变性温度95℃，时间5分钟；变性温度95℃，时间30秒；退火温度60℃，时间30秒；延伸温度72℃，时间1分钟，共计35个循环，循环结束后72℃延伸5分钟，然后冷却保存在4℃。4．视网膜结构及功能检测（1）视网膜电图将充分暗适应后的小鼠按0.004ml/g剂量麻醉后置于MicronIV配套动物台架上，充分散瞳后于角膜表面滴1滴甲基纤维素（2%）以保持其湿润，再将参考电极和地电极分别插入小鼠头部和尾巴根部的浅层皮肤内，然后调整MicronIV-ERG探

8、头（角膜电极）与小鼠眼球相对位置，使得小鼠待测眼与角膜电极恰当接触