基于β-甘露聚糖酶活性基因探讨及固定化研究

《基于β-甘露聚糖酶活性基因探讨及固定化研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、天津大学博士学位论文β-甘露聚糖酶活性基因探讨及固定化研究姓名：喻春皓申请学位级别：博士专业：化学工程指导教师：何志敏20030601摘要本论文对地衣芽孢杆菌6一甘露聚糖酶进行了侧链基团专一性化学修饰和固定化研究。依据文献报道，在确定适宜的修饰条件下，分别用16种典型侧链基团修饰剂对纯化B一甘露聚糖酶进行修饰研究，被修饰的侧链基团主要包括羧基、巯基、二硫键、氨基、胍基、羟基、酚基、甲硫基、咪唑基和吲哚基。结果发现，甲硫基修饰剂、咪唑基修饰剂和吲哚基修饰剂等与酶发生反应后，酶活力急剧下降，初步认为蛋氨

2、酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基等可能为地衣芽孢杆菌6．甘露聚糖酶的活性必需基团。通过化学修饰动力学和统计学分析以及底物保护下的修饰反应，进一步表明，地农芽孢杆菌6一甘露聚糖酶必需活性基团中包含有蛋氨酸、色氨酸及组氨酸等残基。在修饰剂浓度远远大于酶浓度的条件下，修饰反应为拟一级反应，酶必需活性基团中有一个蛋氨酸残基、两个色氨酸残基、一个组氨酸残基。对已知分子结构的6．甘露聚糖酶(如TreeseiMan5A，TfuscaMan5A，户cellulosaMan26A)进行分析，表明地衣芽孢杆菌$一甘露聚糖

3、酶分子的折叠结构为典型的(D∞8．桶式结构，分子表面有～个裂缝状凹槽的催化活性拓扑结构，有两个Glu残基为催化活性基团，分别起到催化和亲核试剂的作用：一个His残基在催化过程中起识别调节作用；而参与酶催化过程的两个Trp残基中一个为催化位提供一个疏水性面，另一个起到调控底物结合的作用；而Met残基可能起到稳定化酶分子活性位环境的作用。在专一性化学修饰的研究基础上，对该酶进行了固定化研究。选用氨基载体(如Sil-NI-12，Chit-NH2，D一380-NH2)作固定化载体，三种醛基功能试剂(甲醛、乙

4、二醛、戊二醛)活化处理氨基载体为二级反应，选用乙二醛活化处理载体固定化酶时较优。对固定化参数(如乙二醛浓度、活化处理时间、偶联时间、给酶浓度等)进行了优化研究，并制得了三种固定化酶。与游离酶相比，固定化酶最适pH均向碱性方向偏移，酶活性最适温度均变高，酶稳定性(包括酸碱稳定性、热稳定性、贮存和操作稳定性1均天津大学博士学位论文B一甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究得到提高。固定化酶酶促水解角豆胶半乳甘露聚糖和魔芋葡甘聚糖反应动力学遵循米氏动力学方程。本文还探讨了固定化酶连续酶解调控魔芋葡甘聚糖产物分

5、子量的操作方式。最后结合B．甘露聚糖酶化学修饰与固定化的研究结果，分析了酶专一性化学修饰与酶固定化之间的关系，重点讨论了专一性化学修饰对酶固定化研究的指导意义，主要体现在四个方面：1)探测酶分子表面特性与侧链基团性质以及与酶活性间的关系，2)固定化策略的确定，3)固定化载体材料的表面分子结构设计，4)酶固定化中双功能试剂的遴选与设计。关键词：D一甘露聚糖酶专一性化学修饰活性基团固定化反应动力学Abs订actABSTRACTSpecificchemicalmodificationandimmobili

6、zationofBacilluslichenifo—rmisp-mannanasewerestudiedinthisdissertation．Onthebasisofthepreviouslyreportedmodificationconditions，thepurifiedenzymewasmodifiedwitll16group—specific-reagents．whichmainlyreacted、Ⅳi也carboxyl-，sulflaydryl一，amino一，guanido-，hydro

7、xyl-，phenol-，methythio一，imidazolyl-，andindolyl-groups，anddisulfidebond．Aftermodifyingwithmethythio一，imidazolyl-andindolyl-modi蛳ngreagents，thesharpdeclinesoftheenzymeactivityofB-mannanasewasfound．Itwasindicatedthatmethionine，histidine，andtryptophanresid

8、uesmightbeessentialgroupsoftheenzymeactivity．Itwasfurtherconfn'medthattheseresiduesweretheessentialgroupsofthep-marmanaseactivitythroughkineticandstatisticanalysisofchemicalmodification,andmodifyingreactionundersubstrateprotection．Whent