芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的纯化及其稳定性研究

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1、天津大学硕士学位论文芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的纯化及其稳定性研究姓名：刘跃申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：齐崴20080501中文摘要p．甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶，应用广泛，多采用微生物发酵制备。本文首先对发酵培养基进行简化与优化，并通过分离纯化制得高纯酶；进而运用圆二色、二级结构预测等方法，对酶的结构及稳定性进行研究，通过添加稳定化试剂并优化操作参数，提高了喷雾干燥产品的稳定性。主要工作如下：对发酵培养基氮源、碳源及无机盐进行筛选优化，确定了简化发酵培养基组成；最终发酵液的单位酶活成本较原始发酵培养基降低63％，大大提高了生产收益，且色素及杂质

2、的含量也明显低于原始培养基，有利于产品的后续精制。B．甘露聚糖酶粗酶液经盐析、超滤、离子交换层析、凝胶层析及羟基磷灰石层析制得电泳纯酶蛋白。电泳分析和凝胶排阻色谱分析估算所得p．甘露聚糖酶分子量一致，约为39kDa。基于确定的氨基酸序列，运用四种算法．APSSP2、SsPR04、PSIPRED、PHD对p一甘露聚糖酶的二级结构及部分性质进行了预测和计算，得到疏水性标度值及滴定曲线，pI=5．505，分子量38005．4。利用远紫外CD对比分析了p一甘露聚糖酶的二级结构和酶活随温度和pH的变化规律，初步探讨了二级结构变化对酶活力的影响，以优选出的CDSSTR算法计算

3、出p一甘露聚糖酶二级结构含量为：0c．螺旋42％，p折叠13％，转角17％，无规卷曲28％，其三级结构类型为：a+D型。考察了四种添加剂(NaCl、淀粉、蔗糖、糊精)在不同浓度下对喷雾干燥制备D．甘露聚糖酶稳定性的影响，结果表明：添加蔗糖和糊精可大幅提高酶的热稳定性，加入50mg／ml糊精，酶活提高50％，效果最佳；通过响应面法优化，确定了喷雾干燥三项主要操作参数的最优值：加料流率4．3mL／min，干燥空气流率31．3L／h，空气进口温度177℃，此时酶活较优化前提高21．9％，达3715．9U儋。关键词：B一甘露聚糖酶，发酵培养基，纯化，稳定性，二级结构预测，

4、圆二色，喷雾干燥，响应面法ABSTRACTp-Mannanaseisanimponanthemicellulase，whichiswidelyusedandusuallyproducedbymicrobialfennentationmethod．Inthisthesis，6rstly，thefennentationmediumwassimplifiedandoptimized，andthepuri6edenzymewasobtainedbysepa眦ingandpuri母ing．Then，thecirculardichroismandthepredictionof

5、proteinsecond习ⅡystnlcturewereemployedininVeStigatingthesmJcturesandstabilizationofp’mannanase．Finally，thestabili妙ofspray—d巧ingproductwasimprovedbyaddingstabilizerandoptimizingoperatingparameters．Themainresults、Ⅳereshownasfollowing：Theni仃ogensources，carbonsourcesandin6rganicsaltsofthef

6、ermentationmediumwerescreenedandoptimized，thesimpli行edfementationmedium、vasdete彻ined．Theunitenzymeactivi哆costof行nalfermentativesolutiondeceasedabout63％comparingwiththatbeforeoptimization，whichsuggestedthatthebenefitwaslargelyincreased．Meanwhile，thepigmentandimpuri够contentsofthefe彻enta

7、tiVesolutionwereobviouslylowerthanthatbeforeoptimization，whichisbeneficialtothesubsequentenzymerefining．Thep—mannanaseofelec协ophoreticpuri够wasprepared仔omcmdeenzymeby锄moniumsulf．ateprecipitation，UF，DEAE一52sepharose，SephadexG．100，andhydroxyapatitechromatography．Themolecularweightofp．man

8、nanas