饲料中三聚氰胺地检测方法

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1、实用标准饲料中三聚氰胺的检测方法 三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，在饲料工业中作为粘合剂使用。目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量。即求出氮的含量，再乘以一定的换算系数(通常用6．25系数计算)得出蛋白质含量。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子，而在原料的粗蛋白检测过程中，用浓硫酸消化过程可以将三聚氰胺分解掉．但在最后的计算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白的比率，造成蛋白含量虚假增高。因此只要

2、在饲料中添加一些含氮量高的化学物质，就可在检测中造成蛋白质含量达标的假象。饲料中非法添加化工原料．可以提高蛋白质检测数值，而用全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时根本不能区分这种伪蛋白氮。在饲料中少量添加三聚氰胺即可大大提高蛋白含量。l三聚氰胺的性质1．1物理性质分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126．12,为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度1．573g／cm3（16℃）。常压熔点354℃(分解)；快速加热升华，升华温度300℃。溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于醚、

3、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。1．2化学性质   三聚氰胺的水溶液呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH值5．5-6．5)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物，

4、其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反应是最重要的反应。2饲料中三聚氰胺的检测方法2．1试剂盒检测法fELISAl利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。2．1．1样品处理称取1．0g均质过的饲料样品于离心管中，加入10ml甲醇充分混合,15000r／min离心10min,取上清液1ml于小试管中用氮气吹干，加入2．5ml10％甲醇和20mmol／lPBS溶液充分溶解，移取100ul进行分析。2．1．2ELISA检测步骤将所有试剂及样品提取液回升温度至室温(20～28℃)，用前按试剂

5、盒的要求稀释所用试剂．取相应数量的微孔条，插入框架，吸取100ul标样或样品提取液到相应的微孔，每孔加入50ul三聚氰胺HRP酶标记物，轻轻混合60s，孵育30minf20-28℃）。然后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用250ul洗液洗板5次；在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干；每孔加入100ul底物溶液，孵育30min(20-28℃)，每孑L加入100ul终止液，用酶标仪读取在450nm下的吸光值。2．1．3作图   文档实用标准以所获得的标准和样品吸光值的平均值除以0标准的吸光值再乘以100为纵坐标

6、，以三聚氰胺浓度半对数为横坐标作标准曲线，确定被测样品的浓度。2．2液相检测法和气相色谱一质谱检测法①试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定；②净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，0一双三甲基硅基三氟乙酰胺fBSTFA)衍生化，以气相色谱一质谱联用仪进行定性和定量测定。2．2．1样品处理称取5．00g试样，准确加入50ml三氯乙酸溶液(10g/l)，加入2m1乙酸铅溶液(22g/l)，摇匀，超声提取20m

7、in，静置2min，取上层提取液约30ml转入离心管，在12000r／min离心5min。分别用3ml甲醇、3ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱。准确移取10ml离心液分次上柱，控制过柱速度在1ml／min以内．再用3ml水和3ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽干后用5％氨化甲醇3ml洗脱，洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入2ml甲醇溶液，涡漩振荡1rain，过0．45I．zm膜，用高效液相色谱仪测定三聚氰胺含量。2．2．2衍生根据液相的定量结果将洗脱液稀释成浓度约为0．5Ixg／ml。

8、分别吸取稀释液0．5ml用氮气吹干，加入250ul吡啶和250ul衍生试剂，加盖，混匀，70cc反应30min，同时吸取0．5ug／ml的标准溶液0．5ml做同步衍生，用气相色谱一质谱联用仪确证。2．2．3仪器条件 ①液相色谱条件 紫外检测器，波长240nm；色谱柱ZORBAXE—clipseXDB-C8,柱长150mm，内径4．6mm，粒度5Ixm；流动相A：B=93：7(A：称取庚烷磺酸钠2．02g和柠檬酸2．10g溶解，定容至1L；B：乙腈)，流动相流速1．0ml／min，进