利用分子生物学技术对伪角毛虫属及全列虫属纤毛虫分类学及系统学的研究

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1、摘要摘要纤毛虫原生动物是最复杂和最高等的单细胞真核生物，由于其独具的两型核、复杂的细胞发生过程和独特的接合生殖方式，因而在分子生物学、细胞生物学和核一质关系的研究上均具有重要的研究价值。由于传统形态分类学和系统学至今存在大量混乱，这就给后续工作的开展带来很大的困难。而分子标记从基因水平反应物种的遗传变异、生物多样性及其进化时序，从而可有效解决纤毛虫传统形态学上的若干存疑．基于此，本工作就纤毛虫在分类和系统归属上的混乱和疑点。利用多种分子生物学技术(RAPD,lc，C'RoRF'LP,PCR-SSCP,SSrRNA基因和rrsl-5．8s-n’s2基因序列比较)对分类地位争议较多的全列虫属、

2、伪角毛虫属中的若干种进行了分类学和系统学两个层次上的研究，并对构建基因树的若干^影响因素进行了探讨．：一，分类学·本工作利用RAPD，PCR-RFLP,PCR-SSCP等分子标记及基因测序技术，对伪角毛虫和全列虫属的多个形态相似种进行了种类区分和鉴定，并对四种伪角毛虫的亲缘关系进行了探讨，从基因水平为传统形态学提供了可靠的依据．1．对黄色伪角毛虫两个种群三个克隆株的Ssr】盼n基因进行了序列测定，均包含1770bp，比较显示两个种群问仅存在两个碱基对的差异。种群内不同克隆株之间完全不存在差异。利用四种随机引物对两个种群三个克隆株进行了随机扩增，所得条带显示种群间存在细微的谱带差异；同种群内

3、不周克隆株之间不存在谱带差异，但存在一定程度的强弱差别。实验证实，伪角毛虫属确实是一个处于活跃分化期的阶元，其分化或变异不仅表现在种问，同时也体现在种下甚至不同的克隆问。2．利用十一种随机引物对三种伪角毛虫和五种全列虫进行了种问及种内关系的RAPD分析，所得清晰条带显示种间均具有明显的差异．利用RAPDistancc软／：f：构建的l摘要邻接(NJ)树表明：伪角毛虫属与全列虫属之间能很好地分开，而不同种群间表现了很好的同源性。3．利用核糖体DNA限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，检测了伪角毛虫属的多个形态相似种。各株系差异显著的PCR-RFLP指纹图谱支持形态学对伪角毛虫属

4、的区分和定义．分析表明，PCR-RFLP之多态性指纹图谱作为纤毛虫传统形．态分类学的辅助手段，可以有效地进行种类区分。同时，我们的研究表明，PCR-RFLP有时可将种群区分开。4．利用单链构象多态性(PCR-SSCP)技术，检测了伪角毛虫属(Pseudokeronopsis)四个形态相似种的六个种群。实验证明，ITSl基因的PCR-SSCP图谱可以很好地用于伪角毛虫属形态相似种的种间及种群区分。5．首次测定了四种五种群伪角毛虫的ITSI-5．8S-ITS2基因全序列，长度均为480bp左右；同时测定了四种伪角毛虫SSrRNA基因全序列，长度约为1770bp；利用几种序列构建的UPGMA系统

5、树均表明：肉色伪角毛虫与黄色伪角毛虫亲缘关系较近，而青岛伪角毛虫与伪角毛虫未定种亲缘关系较近。二、系统学本工作首次测定了柔弱全列虫，以及在形态上十分特殊的的青岛伪角毛虫的SSrRNA基因全序列，以PhyUp软件中的邻接法构建了系统关系树，以Paup软件构建了最大简约树，以Mrbayes软件构建了最大似然树。通过比较和分析几种系统关系树中各分类阶元间的进化关系，表明全列虫属、伪角毛虫属极可能均非单系发生，同时本研究从分子生物学角度支持了二者之间较近的亲缘关系．三、系统扭f构建以纤毛虫动物中的几个属的部分SsrRNA基因为研究对象，初步探讨了不同外类群、内类群的选择，有无外类群，同一基因不同长

6、度，不同构树方法及不同分析软件对构建基因树的影响．r，、，：-关键词：分类学，系统发生，分子标记，全列虫属，伪角毛虫属，纤毛虫．，●’{．’2摘要AbstractCLlhted—讲ozoaisthemostcomplexandhighlydiffc∞ntiatedamongsingie-cdledorsanisms．Owingtolhe廿specialn哺妇dualism,complicatedmorphogeneticproceesanduniqueseminal．把印-odII硝∞(conjugation),ciliatesplay蛔,ormtrolesinmolecularbiolo

7、gy,cellbiolo母'andresc锄hesonrelationshipsbctweellnucleusandoytoplasm．However,lotsofmorphologicalclose-relatedspeciesorsiblingSpeciesneedreassessmentduetotheinsufficientandweakmorphologicalmadmorphogenetiofesawes．W