16s rdna分子生物学技术在除磷菌种群结构分析中的应用

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1、②申请黼济大学工学硕￡学位论文16SrDNA分子生物学技术在除磷菌种群结构分析中的应用(项粉编譬；瀚寐高技术礤蛲黢鼹计划鹕黜)顼融(2092AA801320)。k海前曙光诗矧资助碉}；=l(03sG绷)j培养单位：环境科学与工程学院一级学科：昂境科学与工程二缎学科：蝰境工程礴究生：戴睿指导教师：夏圆消教授副指导教师：傅以钢讲泽二二oo七年一月摘要本研究主要应用PCR-DGGE、PCR产物克隆等16SrDNA分子生物学技术，结合城市污水生物除磷工艺的特点，对平行AN／AO工艺活性污泥中除磷菌的种群结构进行分析。在此基础上，讨论了氧气和N

2、03"等不同电子受体条件对除磷菌种群结构的影响，以及氧气和N03"等电子受体条件分别在不同pH环境下除磷菌种群结构的变化。该方法可以不经培养，利用不同微生物16SrDNA遗传讯息的保守性和差异性对样品的种群结构以及主要菌种的种属进行讨论和鉴定。试验从活性污泥样品中提取总DNA，采用套式PCR对除磷菌的16SrDNAV3区进行扩增，结合DGGE、PCR产物克隆等技术分析环境样品中除磷茵的种群结构。通过DNA测序技术与NCBI(美国国立生物技术信息中心)基因库比对可以对部分主要除磷菌的种属进行鉴定，从而对生物除磷活性污泥中的微生物群落结构

3、得到一个比较全面、客观的认识。平行AN／AO工艺调试过程中，微生物多样性相当丰富且种群结构也比较复杂，对外来的环境冲击影响表现出较强的动态稳定性。污泥的内外回流不可避免的造成了微生物在不同区域中的“流动”，因此大部分除磷菌在不同功能区域中的种群结构差别不大。另检测到少数优势菌群可能是在专性厌氧／缺氧条件下生长的，属于反硝化除磷菌的功能菌群。在该工艺的运行过程中，采用套式PCR方法，结合DGGE对活性污泥样品中放线菌(Actinobacteria)、变形杆菌(Proteobacteria)、产酸细菌(Acidobacterium)等菌群

4、的种群结构进行了分类讨论，结合进出水水质，在分子生物学角度证实了除磷菌在污水处理过程中明显的除磷作用。通过割胶、测序、NCBI比对初步确定了优势菌种的种属。通过对02和N03。等不同电子受体条件下培养驯化的活性污泥中除磷菌的群落结构进行对比分析，讨论了代谢链的差异性所造成的微生物群落结构较为明显的规律性变化，验证了培养驯化方法用于除磷菌分类筛选与富集的可行性。在此过程中，检测到在厌氧／缺氧反硝化除磷过程中的部分优势菌种，该类菌种属于“反硝化除磷菌”的功能菌群。驯化过程在6．5～8．5的pH值范围内，除磷菌的种群结构均较为相近，仅有少数

5、菌种的细菌数量表现出较为简单的规律性摘要变化，表明生物除磷过程中的微生态系统在此pH范围内的稳定性。结果显示，研究中所采用的16SrDNA分子生物学技术，可以对环境样品中的微生物进行快速分析，真实而完整的反映其中微生物群落结构的复杂性和多样性，且环境样品中具有的多种复杂成分对分析的影响不大。FISH、RT--PCR等分子生物学定量分析技术，将是后续研究的热点。如何将这一分析技术用于指导工程实践，是进一步深入研究的主要方向。关键词：16SrDNA，聚合酶链式反应，变性梯度凝胶电泳，克隆，生物除磷，活性污泥ⅡAbstraetABSTRAC

6、TToinvestigatethecharacteristicsofthemicrobialdiversityofphosphorus-accumulatingorganismsintheAN／AOprocessthatarecapableofconductingbiologicalphosphorusremovalinmunicipalwastewatertreatment，themolecularbiologicaltechnologybasedon16SrDNAhasbeenusedsuchaspolymerasechainre

7、action(PCR)，denaturtinggradientgelelectrophoresis①GGE)，cloneoftheproductofthePCRreactionandsOon．Ontheotherhand．thechangeinmicrobialcommunitystructuredependingonthetypeofelectronaceeptor,nitrateoroxygen，andonthedifferentpHofeachtypeofelectronacceptorWasdemonstratedbythea

8、nalysisoftheresultsof16SribosomalDNAfragments．Withmolecularbiologicalmethods，themicrobialcommunitystructureCan