以visfatin%2fnampt为靶标活性化合物筛选

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1、以Visfatin/Nampt为靶标的活性化合物筛选摘要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamideadeninedinucleotide,NAD）是生命体内2002+多种氧化还原反应的辅酶，在很多细胞生理过程中如Ca动员、基因稳定、凋亡、代谢、应激、老化等起着至关重要的作用。Nampt是哺乳动物NAD合成途径的限速酶，调节着细胞内总的NAD水平和线粒体中的NAD水平。此外，Nampt通过控制NAD的合成维持细胞的能量供应，对细胞生存起到了关键性作用。大量研究表明，Nampt在促进细胞分化成熟、参与机体免疫反应和炎症应答、抗细胞凋亡等方面有诸多有益的生理功能，在心脑血管疾病、糖尿病

2、、自身免疫性疾病中有潜在保护作用。在癌症中，肿瘤细胞为了快速增殖，对细胞内NAD水平的依赖比正常细胞更强。研究表明Nampt有促血管生成活性，支持着一些肿瘤细胞的生长，抑制Nampt酶活性可起到很好抗肿瘤作用。这使得Nampt成为近年来药物研究中一个非常有吸引力的靶标。特别是2005年新发现的脂肪细胞因子visfatin具有Nampt的酶活性，使得visfatin/Nampt成为全世界生物学功能研究的热点分子。目前有研究报道的Nampt抑制剂只有4个，尚无任何Nampt激活剂和以Nampt为靶标的高通量筛选工作报道。为寻找首个Nampt激活剂，发现更多不同结构类型的新型Nampt抑制

3、剂，基于本课题组在前期研究中建立的高通量筛选系统，我们展开了以Nampt为靶标的高通量筛选。我们利用已建立的筛选平台，对购自上海国家化合物资源中心的15,200多个化合物在20μM浓度下进行初筛，得到激活率在25%以上的化合物747个，抑制率在60%以上的化合物23个。初筛选出的化合物再进行复筛以确认其活性，复筛中增设对照反应组以排除假阳性结果。复筛后选出102个化合物，在20、2、0.2μM浓度下测定它们的活性，目的在于进一步筛选出活性好、有效浓度低的化合物。在2μM浓度时抑制率大于50%的化合物共6个，分别是：9882、735、2161、4162、7391、6443。我们又深入测

4、定了这6个化合物在体外对Nampt酶活性的半数抑制浓度IC50值，分别为：3.54μM、9.87nM、0.149μM、0.777μM、0.855μM、0.352μM。筛选实验中的质量控制参数Z′因子变化范围在0.52~0.88之间，CV值在0.85~9.02%之间，S/N比值均大于8，符合高通量筛选要求。通过初筛、复筛以及对体外酶活性抑制IC50值测定，我们找到6个有潜在Nampt抑制活性的小分子化合物。进一步，在人肝癌细胞株HepG2上考察化合物733、735、2161、4162、7391对细胞内NAD水平的影响。设置化合物浓度为1、10、100μM，分别孵育HepG2肝癌细胞24

5、小时，高氯酸法裂解细胞，酶循环法测定细胞裂解液-1-第二军医大学硕士学位论文中NAD水平。结果显示，735在1μM浓度下作用24小时，HepG2肝癌细胞内NAD水平降低72.9%（10、100μM时分别为74.04%和77.12%）；2161和7391在100μM浓度下作用24小时，HepG2细胞内NAD水平分别降低60.2%和49.7%；733和4162对细胞内NAD水平的的抑制作用不显著。我们选出735作为抗肿瘤研究的潜在活性化合物。进一步测定了735对HepG2肝癌细胞NAD水平影响的半数抑制浓度IC50值为93.7±3.4nM。同时，考察了735在0~10μM浓度范围内对He

6、pG2细胞的毒性，结果显示，735在0~10μM浓度范围内作用于HepG2细胞24小时，不会引起细胞死亡。而在此浓度范围内，735又能有效引起HepG2细胞内NAD水平降低。因此，我们认为，化合物735没有直接、即时的细胞毒性，而是可能通过抑制Nampt的酶活性，逐渐耗竭细胞内的NAD。另外，我们考察了化合物735对人肝癌细胞株HepG2、人卵巢癌细胞株A2780和人前列腺癌细胞株DU145体外增殖能力的抑制作用。用梯度浓度的化合物分别作用于对数生长期的细胞株72小时，SRB法进行检测。结果显示，735对3种细胞株的增殖表现出不同程度的抑制作用，它对人卵巢癌细胞株A2780和人前列腺

7、癌细胞株DU145增殖抑制的IC50值约为0.3μM，对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制的IC50值约为19.3μM。本研究首次开展了以Nampt为靶标的活性化合物筛选工作，通过体外通量化筛选，发现了6个完全不同于已有Nampt抑制剂的全新结构类型化合物，其中化合物735在细胞水平上表现出较好的活性，但其体内活性还有待进一步确证，其作用机制也需展开深入研究。本研究所得到的先导化合物可以进一步进行结构优化，以期为Nampt的相关研究提供工具，有望发现新的Nam