肠炎沙门氏菌hfq和非编码小rna isre、stnc640毒力相关功能研究

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1、肠炎沙门氏菌Hfq和非编码小RNAIsrE、STnc640毒力相关功能研究VirulenceRelatedFunctionAnalysisofHfqandSmallnon—codingRNAIsrE，STnc640ofSalmonellaEnteritidis国家自然科学基金(31101826，31270171)ChineseNationalScienceFoundation(3101826，31270171)研究生：孟宪臣导师：朱国强教授孟霞讲师扬州大学兽医学院2013年6月孟宪臣：肠炎沙门氏菌Hfq和非编码小RNAIsrE、STnc640毒力相关功能研究肠炎沙门氏菌H

2、fq和非编码小RNAIsrE、STnc640毒力相关功能研究专业：预防兽医学研究生：孟宪臣导师：朱国强教授孟霞讲师中文摘要细菌非编码小RNA(sRNA)可在转录后水平调节基因的表达，是近年来新发现的一类基因调节子。沙门氏菌作为肠道病原菌，其毒力机制、微生物致病机制、基因表达和代谢途径等已得到深入研究，近年来已成为研究RNA介导调控的模式病原菌。鉴于sRNA在调控沙门氏菌生长代谢和致病性等方面发挥十分重要的作用，但大多数sRNA的功能和其靶标基因还不清楚。本研究对肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq以及Hfq依赖性sRNAIsrE和STnc640的毒力相关调控功能进行了如下研

3、究。1肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关功能研究肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，可引起人和动物肠道或全身性疾病。细菌sRNA伴侣蛋白Hfq能介导sRNA结合到靶标mRNA上，促进sRNA完成转录后调控。本研究通过X-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336hfq基因缺失株50336Ahfq，并构建了回补株50336Ahfq／phfq。通过qRT-PCR检测了主要菌毛亚单位sefA、bcfA、fimA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋fliC的表达。结果显示，相比野生株50336，50336Ahfq中

4、sefA的表达水平上调约14倍，ompD上调约2．7倍，其余的菌毛亚单位和fliC的表达均下调明显。运动性试验结果显示50336Ahfq的运动能力与野生株相比明显下降。同时黏附试验结果表明，相比50336，50336Ahfq对Caco．2的黏附能力下降明显。50336、50336Ahfq和50336Ahfq／phfq对一日龄雏鸡的半数致死量LDso分别为9．472×108、2．442×109和2．974×108CFU，表明50336Ahfq对雏鸡的毒力减弱。根据以上结果，推测Hfq可通过调控菌毛相关基因、外膜蛋白ompD和鞭毛亚单位flic的表达影响细菌的毒力。2肠炎沙门

5、氏菌sRNAIsrE毒力相关功能研究sRNAIsrE由沙门氏菌毒力岛编码，在侵染巨噬细胞时表达量上升。本研究通过九．Red扬州大学硕士学位论文同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336／srE基因缺失株50336A／srE，并构建了回补株50336&-isrE／pisrE。生长曲线测定结果显示，50336A／srE和野生株的生长速率无明显差别，qRT-PCR检测到IsrE水平在稳定后期达到最高。利用qRT-PCR检测了主要菌毛亚单位sefA、6班、fimA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋1刍fliC的表达。结果显示，相比

6、野生株50336，50336AisrE中∥蒯、sefA、stbA、sthA、csgA、csgD、外膜蛋白ompD和鞭毛亚单位刀fC表达均表现下调。ompD表达下调95％，推测其可能是IsrE的直接靶标基因。运动性试验结果显示，与野生株相比，50336A／srE的运动能力下降。同时黏附试验结果显示，相比50336，50336A／srE对Caco．2的黏附能力减弱。50336、50336A括征和50336AisrE／pisrE对一日龄雏鸡的半数致死量LD50分别为2．901×108，4．084×108和3．101×108CFU，表明50336AisrE对雏鸡的毒力减弱。Isr

7、E对Hfq的依赖性检测结果显示，50336Ahfq中IsrE水平只有野生株的30％，推测西厄可能在Hfq的协助下，通过调控外膜蛋白ompD并影响菌毛、鞭毛以及其他未知靶标基因的表达影响细菌的毒力。3肠炎沙门氏菌sRNASTnc640毒力相关功能研究STnc640为鼠伤寒沙门氏菌中新发现的一种sRNA，具有Ufq依赖性，但其功能未知。通过TargetRNA软件发现bcfA和J，；，剃可能是STnc640的靶标基因，推测其可能对菌毛介导的细菌毒力具有调控作用。本研究通过九-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336stnc64