海洋亚硫酸杆菌m44鉴定及代谢产物的研究

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1、海洋亚硫酸杆菌M44的鉴定及代谢产物研究摘要本课题采用的实验菌株M44是从中国东海（东经122.8º，北纬30.9º）海水中分离得到的一株低嗜盐菌，最适生长盐度为2.5%，经MTT法筛选表明，菌株M44发酵液对HL-60、HepG2、SW1990细胞株均有较强的细胞毒活性。对菌株M44产生的次生代谢产物的热及酸、碱稳定性研究结果表明，发酵液中活性物质对热反应比较稳定，90℃处理30min后细胞毒活性基本不变，但发酵液在pH3.0和pH11.0条件下处理2h后调回其原始pH，细胞毒活性基本丧失。通过抽提菌株M44的总DNA模板，PCR扩增

2、16SrDNA序列，Blast比对并构建进化树，结果显示其与亚硫酸杆菌（Sulfitobacterdubius）的进化位置最为接近，它们的相似度高达99%。该菌革兰染色、培养特征、生长特性、部分生理生化特征、胞壁脂肪酸组分、基因组G+C%等研究也显示该菌株具有亚硫酸杆菌的特征，因此鉴定其为亚硫酸杆菌。在对菌株M44的发酵条件进行优化后，得到其最佳摇瓶发酵条件为：温度25℃、初始pH7.0、装液量50mL/250mL、接种量4%。在此条件下培养的发酵液其细胞毒活性最强。小量发酵后的发酵液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，分别测定其

3、对HL-60、HepG2、SW1990细胞株的细胞毒活性，结果发现活性成分分布在乙酸乙酯萃取部分中，为中等极性物质。摇瓶大规模发酵得菌液60L，离心除菌体后，上清用等体积乙酸乙酯充分萃取三次，减压蒸干，最后得到乙酸乙酯浸膏5g。通过ODSC-18柱层析、SephadexLH-20凝胶层析以及RP-HPLC等各种色谱技术，对M44产生113的次生代谢产物进行分离纯化，共得到了25个单体化合物。利用PPH-NMR、PPC-NMR、EI-MS、等波谱技术并结合化合物的理化性质确定了其中6个化合物的结构。它们分别是：分别为Ⅰ、环（缬氨酸-亮氨酸

4、）；Ⅱ、环（苯丙-缬氨酸）；Ⅲ、环（苯丙-亮氨酸）；Ⅳ、环（亮-异亮氨酸）；Ⅴ、环（苯丙-异亮氨酸）；Ⅵ、环（色-脯氨酸）。化合物的结构如下：-1-第二军医大学硕士学位论文OOONHNHNHHNHNHNOOOCyclo(Val-Leu)Cyclo(Phe-Val)Cyclo(Phe-Leu)OOONHNHNHNHNHNNOHOOCyclo(Leu-Ile)Cyclo(Phe-Ile)Cyclo(Trp-Pro)化合物的活性测定结果表明：环（亮-异亮氨酸）对HepG2和Hep2细胞株均表现出一定的细胞毒活性，其ICB50B分别为118μg

5、/mL和135μg/mL，其余各单体化合物对4种肿瘤细胞株的细胞毒活性均不明显；分离得到的化合物对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌的抗菌活性均不明显，且对菌株M44产生代谢产物的影响也不明显。综上所述，本工作主要针对海洋亚硫酸杆菌M44及其生物活性物质进行了初步的研究，并分离得到了6个环二肽结构，为深入开发东海微生物资源奠定了一定的工作基础。关键词：亚硫酸杆菌，16SrDNA序列分析，分离纯化，环二肽，代谢产物，细胞毒-2-海洋亚硫酸杆菌M44的鉴定及代谢产物研究AbstractInthepresentstudy,M44wasis

6、olatedfrom30m-deepseawaterfromtheEastChinaSea(122.8ºE，30.9ºN).Thistestingstrainisahalophilicmicrobeanditsoptimumsaltconcentrationis2.5%.TheevidencefromMTTmodelscreeningdemonstratedthatthefermentationbrothofthisstrainpowerfullyinhibitedthegrowthofHL-60,HepG2andSW1990.Thei

7、nfluenceofdifferenttemperaturesandpHvaluesonthecytotoxicactivityoffermentationbrothwasalsotested.Thefermentationbrothwasfoundtobestabletoheatingbecauseitscytotoxicactivitywasnotmarkedchangedaftertreatmentat90℃for30min,whilethecytotoxicactivityoffermentationbrothvariedwit

8、hpHvalueanddecreasedrapidlyatpH3.0andpH11.0particularly.BasedonthegenomicDNAextraction,PCR,sequenceanal