一株茶碱降解菌的分离和鉴定

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1、!"卷#期微生物学报&’()!"0’)#"$$"年%$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,’-./"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!一株茶碱降解菌的分离和鉴定"%，"，5"，5"，5"，5""许玫英岑英华邓穗儿孙国平（%中国科学院武汉病毒研究所武汉!5$$2%）（"广东省微生物研究所广州#%$$2$）（5广东省菌种保藏选育重点实验室广州#%$$2$）摘要：从制药废水生物处理系统的活性污泥中经富集分离到一株能以茶碱作为唯一碳、氮源生长的茶碱降解菌6+75，该菌株可以利用茶碱的最高浓度为5$$$89:

2、;。当茶碱浓度为B是该菌株%$$$89:;时被彻底降解的时间仅需!<=。6+75菌株降解茶碱的最适>?为<@$。A降解茶碱的必需元素。采用%CD/E0F序列分析法及传统的生理生化特征鉴定法对该菌株进行鉴定，结果表明，6+75的%CD/E0F的核苷酸序列与善变副球菌（!"#"$%$$&’()#’&*&’）F6GG"#5C!的同源性为11@2H，在细菌系统发育分类学上属于变形菌!亚类，I=’J’-K+,./组：副球菌属，善变副球菌。关键词：茶碱，生物降解，%CD/E0F，善变副球菌中图分类号：L%2"文献标识码：F文章编号：$$$%4C"$1（"$$"）$#4$#"C4$<茶碱为甲基黄嘌呤类衍生物

3、，普遍存在于茶叶、咖啡、可可等食品中。在临床医学上，茶碱以其具有强心利尿、促进支气管舒张、抗炎和免疫调节等作用而被广泛应用。随着医药方面需求量的增长，以及含茶碱食品在食品工业中的广泛应用，在工业废水中茶碱的污染也越来越严重。大量的研究也表明，茶碱的生物安全性较窄，当血药浓度超过"$89:;［%M5］时，易产生不良反应，甚至造成死亡。由此可见，有必要寻找快速、有效地消除环境中的茶碱的方法。但目前国内外对于这方面的污染问题的治理并没有相关的报道。本研究从某制药厂废水处理系统的活性污泥中分离到一株能以茶碱为唯一碳、氮源生长的茶碱高效降解菌株，并研究了该菌株降解茶碱的特性。随着分子生物学的发展，人们逐

4、渐认识到单靠菌株的常规生理生化特征为指标，而缺乏基因水平的数据作支持，已不足以对细菌［!］鉴定提供充分有力的证据。%CD/E0F序列分析法已被广泛地应用于分子系统发育分［#］类学研究中。本研究同时采用%CD/E0F序列分析法和传统的菌种生理生化特征鉴定法对该菌株进行鉴定，确定了6+75在系统分类学上的准确地位。!材料和方法!"!样品试验所用样品采自广州某制药厂废水生物处理系统中的活性污泥。"广东省自然科学基金资助项目""通讯联系人作者简介：许玫英（%12!3），女，广东省饶平县人，广东省微生物研究所助理研究员，中国科学院武汉病毒研究所在职硕士研究生，主要从事环境生物工程研究。收稿日期："$$%

5、4%"4$#，修回日期："$$"4$%4"#6期许玫英等：一株茶碱降解菌的分离和鉴定6"摇床培养，以一周为一驯化周期，观察生长情况。当培养基出现浑浊时，稀释涂布于上述培养基平板上，挑取单菌落，接种于上述培养

6、基斜面。!"%细菌生长的测定以波长)++81处的浊度表示。!"&茶碱的测定［)］紫外分光光度法：以波长"<&81处的浊度表示。高压液相色谱法（#$:2）：2’?柱，测定波长为"<’81，流动相为甲醇@水A"?@<"，流速为’(+1:B1C8，茶碱的停留时间约为6(01C8。!"’不同()培养基的配制采用=3"#$%&—!#"$%&缓冲液（’B’61D4B:）配制以茶碱为唯一碳、氮源的培养基;#分别为6(+，)(+，<(+，?(+，E(+，’+(+，’’(+，’"(+。!"*细菌总+,-的提取采用-F-G蛋白酶!裂解，十六烷基三甲基溴化铵（2HI9）沉淀细菌碎片和多糖，再用［<］异丙醇沉淀提取总

7、F=I。!"./01引物采用细菌’)-JF=I通用引物."<（6KGILILHHHLIH22HLL2H2ILG0K）和M’6""（6KG［?］IILLILLHLIH22IL22L2IG0K）。!"2/01扩增$2M扩增体系总体积为’++!:：超纯水<0(6!:，’+N$2MO5PP/J’+!:，"(+11D4B:Q=H$?!:，."<引物"!:，M’6""引物"!:，’RBH3S酶"(6!:，总F