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《荧光光谱技术在生物大分子相互作用以及解旋酶酶促反应研究中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、荧光光谱技术在生物大分子相互作用以及解旋酶酶促反应研究中的应用【摘要】：本研究选取当前生物学领域中广泛采用的荧光光潜检测技术(如:荧光交联相关光谱技术,FCCS:荧光偏振检测技术,Florescenceanisotropy以及荧光强度衰退检测技术,Photoluminescencedecay)并深入开展其在生物大分子相互作用机制中的应用研究,研究结果与结论如下:一.荧光交联相关光谱技术及其在RecQ解旋酶活性作用研究中的应用实验选用双荧光标记互补链小片断寡聚核苷酸链作为研究底物,利用荧光交联相关光谱(FluorescenceCross-Correlati
2、onSpectroscope,FCCS)荧光检测技术实时监控大肠杆菌RecQ以及人类RecQ5β解旋酶蛋白的酶促反应活性。结果表明荧光交联相关光谱技术FCCS适用于实时监测RecQ解旋酶蛋白的酶促反应活性。且该检测体系具有较高的灵敏性与稳定性。1)应用FCCS技术监测E.ColiRecQ解旋酶蛋白的双链DNA解链活性本实验选取高度保守的大肠杆菌E.ColiRecQ解旋酶(Xuetal.,2003)作为研究对象,并采用FCCS技术作为检测手段,监测E.Coli荧光光谱技术在生物大分子相互作用以及解旋酶酶促反应研究中的应用【摘要】：本研究选取当前生物学领域中
3、广泛采用的荧光光潜检测技术(如:荧光交联相关光谱技术,FCCS:荧光偏振检测技术,Florescenceanisotropy以及荧光强度衰退检测技术,Photoluminescencedecay)并深入开展其在生物大分子相互作用机制中的应用研究,研究结果与结论如下:一.荧光交联相关光谱技术及其在RecQ解旋酶活性作用研究中的应用实验选用双荧光标记互补链小片断寡聚核苷酸链作为研究底物,利用荧光交联相关光谱(FluorescenceCross-CorrelationSpectroscope,FCCS)荧光检测技术实时监控大肠杆菌RecQ以及人类RecQ5β解
4、旋酶蛋白的酶促反应活性。结果表明荧光交联相关光谱技术FCCS适用于实时监测RecQ解旋酶蛋白的酶促反应活性。且该检测体系具有较高的灵敏性与稳定性。1)应用FCCS技术监测E.ColiRecQ解旋酶蛋白的双链DNA解链活性本实验选取高度保守的大肠杆菌E.ColiRecQ解旋酶(Xuetal.,2003)作为研究对象,并采用FCCS技术作为检测手段,监测E.ColiRecQ蛋白的酶促反应活性。研究结果表明:在一级反应条件下,E.ColiRecQ蛋白对底物的作用方式具有温度依赖性;此外,DNA底物核苷酸链的长度也会影响蛋白对底物的协同作用程度,进而引发酶促反应
5、活性的显著差异。在多极反应条件下,DNA底物链长度不会影响酶蛋白对底物协同作用效应,主要由于反应体系中底物浓度远远大于酶蛋白浓度,该结果再次印证了一级反应条件下蛋白酶促活性的差异是由于酶蛋白对底物协同作用效应差异而引起的。2)应用FCCS技术监测RecQ5β解旋酶蛋白的互补单链DNA链“退火”活性本研究采用FCCS技术作为检测手段,监测人类RecQ5β解旋酶蛋白的酶促反应活性。研究结果表明RecQ5β酶蛋白能够引发互补单链DNA链“退火”反应,且该反应活性与DNA底物链长度无关。通过研究RecQ5β酶蛋白在不同孵育温度下对DNA的底物亲和力,结果表明Re
6、cQ5β酶蛋白对底物DNA结合能力不受孵育温度的影响,进而印证了较高温度下较强的互补单链DNA链“退火”程度归因为RecQ5β酶蛋白自身具有的酶促反应活性。该研究还检测了反应体系中镁离子浓度对互补单链DNA链“退火”程度的影响,结果表明人类RecQ5β解旋酶蛋白的互补单链DNA链“退火”活性不具有镁离子依赖性。二.稳态荧光偏振检测技术在HIV病毒整合酶蛋白酶促反应活性研究中的应用本研究采用稳态荧光偏振检测仪Beacon2000(PanVera,Madison,WI)来实时监控HIV病毒整合酶蛋白与底物DNA结合过程中稳态偏振荧光数值的变化。本试验研究了两
7、类主要的针对HIV病毒复制以及重组HIV整合酶蛋白催化特性的遗传抑制通路(N155H以及G140S/Q148H)。该研究采用稳态荧光偏振检测技术,成功实时监测了野生型以及突变型HIV整合酶蛋白的DNA结合活性以厦3’端处理活性。结果表明N155H,G140S,Q148H以及G14QS/Q148H每种整合酶遗传突变体都会对整合酶蛋白活性产生抑制作用,然而抑制程度依据突变类型的不同存在不同程度的差异。其中Q148H突变在单独存在的情况下对抗病毒药物RAL具有最强的抗药性;G140S则表现出较弱的抗药性;然而G140S/Q148H双重突变体却表现出极强的抗药性
8、,且此时病毒复制水平类似于野生型HIV病毒。但是研究表明Q148H突变不仅抑制了
