灰葡萄孢乙酰化蛋白BcHpt的功能研究

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文灰葡萄孢乙酰化蛋白BcHpt的功能研究FunctionalanalysisoftheacetylatedproteinBcHptinBotrytiscinerea研究生姓名苏美玲指导教师梁文星教授学科专业植物病理学研究方向分子植物病理学中国.青岛2018年6月FunctionalanalysisoftheacetylatedproteinBcHptinofBotrytiscinereaThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillment

2、oftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomySuMeiling（DepartmentofAgronomyandPlantProtection）Supervisor:LiangWenxingQingdao.ChinaJune,2018青岛农业大学硕士学位论文摘要独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与

3、我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日2灰葡萄孢乙酰化蛋白BcHpt的功能研究摘要由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）引起的灰

4、霉病是蔬菜、水果种植上最为常见的一类病害，可侵染200多种经济作物，造成严重的经济损失。尽管国内外在灰霉的防治方面取得了一定的进展，但目前仍以化学防治为主。目前已发现灰霉对多种药剂出现了抗性，甚至多药抗性，造成了严重的经济损失及农药残留污染，威胁人类健康。因此，灰葡萄孢致病机制的研究，以及新的药剂靶标的开发对于灰霉病的防治具有重要意义。蛋白乙酰化是一种普遍存在、可导致蛋白质生化特性及构像改变、且可逆调控的一种蛋白质翻译后修饰的方式，几乎参与了所有的生物学过程。目前蛋白质乙酰化修饰在丝状真菌中报道较少，本实验室对灰葡萄孢的乙酰化蛋白质组进行LC-M

5、S/MS研究分析，共鉴定到954个蛋白中存在1582个乙酰化位点。进一步分析表明，其中6个已报道的与致病性相关的蛋白也存在乙酰化修饰，其中包括灰霉双组份信号途径的关键元件BcHpt，此关键元件BcHpt的功能域中存在乙酰化修饰位点。该信号途径在酵母中研究较多，与外界胁迫响应、抗药性及致病性密切相关，目前尚没有关于乙酰化蛋白BcHpt在灰葡萄孢致病过程中的功能分析的报道。本研究对乙酰化蛋白BcHpt在灰霉菌致病过程中的功能进行了分析。由于BcHpt在灰霉菌中是生长必需基因，不能采用直接敲除的方法研究其功能。因此，我们构建K161QBcHpt的三个回

6、补表达载体：B05.10-WT-pyf11，△BcHpt-pyf11及△K161RBcHpt-pyf11。其中R和Q的突变分别模拟赖氨酸位点乙酰化前后的状态。将其转入野生型受体菌株B05.10后，再进一步将原有BcHpt基因敲除，从而获得突变回补菌K161RK161Q株和乙酰化位点突变的回补菌株△BcHpt和△BcHpt，用于研究其功能。实验结K161R果表明：在模拟去乙酰化状态下，△BcHpt在生长表型上与野生型无明显差别，而K161Q在模拟乙酰化状态下，△BcHpt的生长速率、对不同的胁迫压力的敏感性和在番茄叶片上的致病力都有显著下降。通过w

7、esternblot检测高渗透甘油（HOG）信号途径中K161QK161R蛋白质的磷酸化水平，结果表明：BcHpt导致BcSak1的磷酸化下降，而BcHptK161Q使BcSak1的磷酸化有所下降但仍高于BcHpt。该结果证明K161的乙酰化修饰可以影响BcHpt在灰葡萄孢HOG信号途径中的功能。通过测定BcHpt的乙酰化修饰对氧化K161Q胁迫响应相关基因表达量的影响，结果表明：在△BcHpt中两个氧化压力响应基因K161RBcYAP1和BcSKN7的表达量显著高于野生型，而△BcHpt中则无明显变化。本项目在前期研究的基础上明确了BcHpt乙

8、酰化修饰的生物学功能，有助于揭示蛋1白乙酰化修饰在病原菌侵染中的作用，并为灰霉病的治理提供理论依据。关键词：蛋白乙酰化；灰葡萄孢；致病性