CD59活性位点突变对T淋巴细胞白血病作用机制及与AKT信号通路的研究.pdf

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1、分类号：R392.11密级：公开学校代码：11065学号：2014010027学术博士学位论文CD59活性位点突变对T淋巴细胞白血病作用机制及与AKT信号通路的研究作者姓名韩淑毅指导教师高美华教授学科免疫学培养单位医学部基础医学院答辩日期2018年5月9日CD59活性位点突变对T淋巴细胞白血病作用机制及与AKT信号通路的研究摘要急T-淋巴细胞白血病是一种以骨髓和外周血中未成熟T细胞积聚为特征的血液恶性肿瘤。即使接受了高剂量的多药化疗或造血干细胞移植等积极的治疗方案，付出巨大的急性和长期副作用的代价，仍有约15%的儿童患者和40%的成人患者因为获得治疗耐药性而复发；生存前景黯淡。因此探究T

2、-ALL的分子发病机制，寻找可应用于T-ALL治疗的细胞表面蛋白对患者的个性化治疗、降低化疗毒性、提高患者的生存时间具有重要意义。CD59分子是一种参与T淋巴细胞活化和信号转导的GPI锚定蛋白。CD59可以阻止C9结合C5b678复合物，影响膜攻击复合物的形成，以帮助肿瘤细胞逃避免疫监控。在大部分实体瘤中CD59的表达水平都明显高于相邻的正常组织，相比较其他的膜补体调节蛋白它更直接或间接的参与了癌变和肿瘤进展，发挥了并有可能是多种肿瘤治疗的有效靶点。但是在急性淋巴细胞白血病中，CD59与白血病细胞增殖与凋亡之间的具体关系和作用机制却需要进一步探讨。另有研究表明在T-ALL发生和进展过程中

3、，涉及多种突变或过度激活的信号通路如ERK、AKT、STAT3、Notch1等，信号途径特异性抑制剂，也成为设计肿瘤治疗药物的一条思路。因此本课题通过体内和体外实验，分析了CD59在急性T淋巴白血病进展中的作用，初步探讨了急性T淋巴白血病中调控细胞增殖、分化和凋亡的几条关键信号途径与CD59表达的相关性。试图通过寻找与CD59作用相关的上下游的关键蛋白，研究CD59及其分子机制，为疾病的治疗寻求新的靶点。CD59的核磁共振三维结构分析发现，Phe23、Cys39、Trp40、Leu53残基形成一活性区域。这些残基位于疏水沟内，其中Trp40位于疏水沟的底面。集中于Trp40的保守疏水沟是

4、CD59补体活性位点，是CD59分子发挥补体抑制功能的重要功能残基。本课题通过比较分析了W40位点敲除后CD59功能的变化，进一步研究此位点在CD59中的关键作用，为基因靶向敲除在肿瘤治疗的应用提供基础的资料。另课题组前期研究发现，在动脉粥样硬化等疾病中，与CD59分子有协同作用的载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)在多种肿瘤中也过表达，但其在淋巴细胞白血病中的作用尚未报道。因此本课题组浅显分析了ApoE在淋巴细胞白血病中的基I因多态性分布差异。综上所述，本课题组从以下几个方面进行了深入研究。首先临床样本中发现，在急性T淋巴细胞白血病患者骨髓T淋巴细胞表面存在CD59的

5、高表达。随后，本课题组选用急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞进行体外实验。发现Jurkat细胞中CD59不仅具有补体调节功能，还参与细胞增殖和凋亡。通过构建的急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型也验证，CD59过表达促进了T淋巴白血病细胞的增殖；而CD59分子Trp40位点的突变降低了CD59分子抑制凋亡的功能。并且本课题组初步探究了CD59调控细胞凋亡相关的信号通路和可能的分子机制。目的：1、研究收集到的临床急T-淋巴细胞白血病患者骨髓T-淋巴细胞表面CD59的表达；利用收集到的临床淋巴瘤样本研究CD59、Bcl-2、Bax与淋巴瘤恶性转化的相关性。2、通过构建并研究CD59稳定高表达，

6、CD59稳定高表达但W40位点突变，CD59稳定高表达但K41位点突变的Jurkat细胞株，探究CD59过表达，及W40、K41位点突变对Jurkat细胞增殖、抗补体、凋亡等生物学功能的影响。3、构建急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型，为研究人类淋巴细胞白血病发生和发展规律提供便利。并利用构建的急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型，研究淋巴细胞中CD59过表达和W40位点突变对白血病进展的影响。4、探究CD59调控Jurkat细胞凋亡过程中涉及的信号途径。5、分析正常人群与急性T淋巴细胞白血病人中ApoE基因型的多态性分布。方法：1、收集32例急性T淋巴细胞白血病患者和32例健康者的骨髓样本，利用流式

7、细胞仪进行了CD59阳性分析。收集40例T-淋巴瘤样本和40例B-淋巴瘤样本，利用免疫组织化学检测样本中CD59、Bcl-2、Bax的表达情况。2、利用基因工程技术构建CD59、CD59W40突变、CD59K41突变表达慢病毒，并通过慢病毒感染，建立了CD59稳定高表达、CD59稳定高表达但W40位点突变、CD59稳定高表达但K41位点突变的Jurkat细胞株。通过荧光显微镜观察绿色荧光，流式细胞仪检测增强绿色荧光蛋白的表达，实时定