嗜人按蚊micrornas的表达谱分析

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1、温州医学院硕士学位论文论文题目：喳厶撞蚊虫i丛Q8瞠△墨的麦达谱分析答辩委员会成员：搂丞鏖教授论文答辩日期：至Q!墨生曼县!昼旦温州医学院硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第一部分嗜人按蚊的饲养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．13第二部分小RNA测序分析嗜人按蚊miRNAs表达谱材料和

2、方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23第三部分Northern杂交验证嗜人按蚊不同发育期的miRNAs表达材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．t36实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45附象⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．53独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64一'温州医学院硕士学位论文嗜人按蚊microRNAs的表达谱分析中文摘要MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的调控基因表达的大小约19-24个碱基的单链小分子非编码RNA，在进化上高度保守，它广泛存在于动物、植物、细菌、病毒等多种生物体内。研究揭示miRNAs与胚胎的发

4、育、干细胞分化、细胞凋亡、以及不同种类肿瘤的发生、发展相关，此外miRNAs还可以通过调控宿主的基因表达来调控病原的感染。miRNAs经RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)作用降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译从而达到调控作用。在线虫、果蝇、小鼠和人等物种已经发现的miRNAs功能研究中发现miRNA的表达水平在不同组织、不同生长发育阶段存在显著差异，这一特征和其他参与调控基因表达的分子相同，同时也提示miRNA有可能参与基因表达的调控。迄今为止，蚊子，昆虫中有关miRNAs的鉴定报道有

5、限，蚊子和昆虫通常做为传播许多人类病原体的必要载体。2003年，Wang等在冈比亚按蚊中通过生物信息学的方法发现了与果蝇miRNA序列相近的38种miRNAs。2007年底，ChristineBrunel等采用小RNA克隆结合生物信息学分析方法鉴定了18种冈比亚按蚊的miRNAs，并分析了冈比亚按蚊在不同生长发育阶段miRNA表达谱的差异。Knockdown冈比亚按蚊Dicerl和AgolmRNA后(冈比亚按蚊的miRNA合成受阻)，结果显示冈比亚按蚊对疟原虫的易感性增加了。2008年Mead等

6、采用小RNA克隆和生物信息学方法在斯氏按蚊中鉴定出27种miRNAs，并揭示miRNA可能有调节蚊生长发育和疾病传播过程的作用。2010年scalsky等分析鉴定了致倦库蚊成蚊和白纹伊蚊c7／10细胞的miRNAs，发现miRNAs的表达在感染西尼罗病毒(WNV)后存在差异，提示miRNAs可能有调控病毒感染的作用。嗜人按蚊是我国特有的蚊种，也是中国疟疾的重要传播媒介。但是目前有关嗜人按蚊miRNAs的研究尚未见报道。本研究通过illuminaHiseq2000高通量测序和生物信息学分析方法，首

7、次对嗜人按蚊miRNAs的表达谱进行系统性分析，丰富了蚊miRNA并揭示一些新的蚊特异miRNAs。并用Northernblot鉴定了部分miRNAs在嗜人按蚊不同生长发育阶段的差异表达，为进一步研究差异表达的miRNAs在调控蚊生长发育及其与病原体之间的作用机制研究提供了基础。目的1．通过illuminaHiseq2000高通量小RNA测序，生物信息学分析方法，分析嗜人温州医学院硕士学位论文按蚊miRNAs的表达谱，丰富对蚊miRNAs了解。2．Northernblot鉴定miRNAs在嗜人按

8、蚊不同生长发育阶段的表达差异，为进一步研究miRNA在蚊子不同生长发育过程中的调控机制提供依据。研究方法1．i1luminaHiseq2000高通量小RNA测序及生物信息学分析嗜人按蚊miRNAs表达谱。1．1样品收集：成蚊为羽化后48h的嗜人按蚊成蚊。收集时4℃短暂冷冻分雌雄后分别收集。样本收集后液氮快速冷冻后置于-80。C储存。1．2RNA提取和鉴定：mirVanaTMmiRNAIsolationKit提取各样本的总RNA，核酸蛋白分析仪检测浓度及纯度，并用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提总