细菌信号N-酰基高丝氨酸内酯与植物中受体GCR2相互作用的研究

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文细菌信号N-酰基高丝氨酸内酯与植物中受体GCR2相互作用的研究论文作者：侯鹏飞学生类别：全日制专业学位类别：工程硕士领域名称：生物工程指导教师：宋水山职称：研究员DissertationSubmittedtoHebeiuniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiologicalEngineeringRESEARCHONINTERACTIONSBETWEENN-ACYLHOMOSERINELACTONE(AHL)ANDITSRECEPTORGCR2INPLANTbyH

2、ouPengfeiSupervisor:Prof.SongShuishanApril2017I摘要革兰氏阴性细菌可以产生一种用于菌群活动的信号分子，即N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyL-homoserineLactones,AHLs)。近年来各项研究表明AHLs不仅能被革兰氏阴性细菌感知，同样也被植物感应，引发植物一系列生理生化活动。3-碳基己酯酰基高丝氨酸内酯(N-3-OxohexanoyL-DL-homoserineLactone,3OC6-HSL)是植物许多病原菌产生的群体感应信号分子AHL中的一种，前期研究实验证明3OC6-HSL可以增强植物的抗盐能力

3、及促进植物主根生长，可以在农作物增产抗病方面发挥重要的作用。实验室前期研究使用生物素和氚标记的信号分子，利用酶联免疫法、放射性配基法对AHL与GCR2蛋白的相互作用进行受体动力学分析，也分析了3OC6-HSL与GCR2结合的特异性、饱和性、可逆性和竞争性，发现GCR2作为潜在的G蛋白偶联受体与信号分子3OC6-HSL存在一定程度的结合作用。因此，证明GCR2与信号分子3OC6-HSL是否存在真正意义上的结合以及发生结合后3OC6-HSL的信号如何传递转导是本次研究的重点。在本次研究中，使用微量热泳动技术（MST）证明植物蛋白GCR2与菌群活动的信号分子3OC6

4、-HSL是否具有受体动力学特征。实验结果表明，GCR2蛋白与3OC6-HSL具有受体动力学特征，其结合解离常数Kd值为25.15nM，显示出较高的结合力，也证实了GCR2蛋白与3OC6-HSL存在结合作用。为探究信号分子3OC6-HSL与GCR2蛋白的具体结合位点，使用分子模拟对接软件Autodock4.0计算3OC6-HSL与GCR2的氨基酸结合位点，经过精准对接后，得到四个结合力较强的氨基酸位点，进行氨基酸结合位点敲除，对突变蛋白进行表达纯化，使用微量热泳动技术（MST)计算3OC6-HSL与GCR2突变体蛋白的结合力。实验结果证明了在3OC6-HSL与G

5、CR2蛋白结合的过程中，Val、Lys两个氨基酸位点具有结合作用，属于3OC6-HSL与GCR2蛋白的结合位点。为了解3OC6-HSL与GCR2蛋白结合后，下游信号如何转导，使用泛素分离酵母双杂交系统来证实GCR2与G蛋白的α亚基GPA1存在相互作用，并且使用信号分子3OC6-HSL处理互作蛋白发现，GCR2与GPA1存在一定程度的解离，说明当GCR2蛋白感受到3OC6-HSL信号后，GCR2蛋白会通过G蛋白的作用来调节下游靶蛋白，从而实现信号分子3OC6-HSL在植物体内的转导。关键词：GCR23OC6-HSL受体结合位点IIABSTRACTGram-neg

6、ativebacteriacanproduceasignalingmoleculefortheactivityofbacteria,N-acyl-L-homoserineLactones(AHLs).Inrecentyears,studieshaveshownthatAHLscannotonlybeperceivedbyGram-negativebacteria,alsoinducedbyplant,triggeringaseriesofphysiologicalandbiochemicalactivitiesofplant.N-3-Oxo-hexanoyL-

7、DL-homoserineLactone(3OC6-HSL)isoneofthequorum-sensingmoleculeswhichproducedbymanypathogens.Thepreliminarystudyshowsthat3OC6-HSLcanenhancethesalttoleranceofplantsandpromotethegrowthofplantroot,whichplayanimportantroleincropyieldanddiseaseresistance.Intheearlystudy,weusebiotinandtrit

8、ium-labeledsignalmo