mir-200a及其甲基化在结直肠癌中的作用研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文miR-200a及其甲基化在结直肠癌中的作用研究StudiesofmiR．200aanditsmethylationincolorectalcancer课题来源：学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院何楠韩慧霞教授病理学与病理生理学学术型硕士研究生基础医学院2013年5月20日广州miR-200a及其甲基化在结直肠癌中的作用研究硕士研究生：何楠指导教师：韩慧霞教授摘要研究背景：结直肠癌是我国最常见的、对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一。近年来，随着人们生活水平的提高，生活习惯的改变，结直肠癌

2、的发病率逐年上升。结直肠癌根治术治疗效果显著，但由于癌组织在早期已经发生侵袭和转移，它仍然对患者的生命健康具有极大威胁。因此，探讨结直肠癌发生及转移的机制，仍是肿瘤学的迫切任务。甲基化是真核细胞中DNA正常的修饰方式。在正常发育的早期阶段，甲基化和去甲基化的交替进行是细胞得以生长和分化的关键程序，在保持细胞基因组稳定性中甲基化也起着至关重要的作用。同时发现，在许多人类肿瘤中也有不同程度的DNA异常甲基化现象。启动子区CpG岛发生异常高甲基化可导致基因转录沉默，使抑癌基因、细胞周期调节基因、凋亡基因等表达极度降低或不表达，参与肿瘤的发生

3、发展。在许多恶性肿瘤的癌前病变中发现了多个抑癌基因的CpG岛高甲基化。这说明，启动子区CpG岛高甲基化在肿瘤的早期阶段已存在。DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)是DNA甲基化发生、完成、持续的重要作用酶。目前发现的DNA甲基化转移酶主要有四种即DnmTl、DnmT2、DnmT3a、DnmT3b。研究表明，DNMTI主要作用是对新合成的DNA中文摘要链进行甲基化修饰并维持，在乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中均表达异常增高，并与肿瘤的分化程度、临床分期或(和)预后不良有不同程度的相关性。DNMTl过

4、表达会导致多种基因启动子区域CpG岛甲基化。近年来微小RNA(microRNA，miRNA)逐渐被研究者重视，成为肿瘤研究的热点。miRNA是真核生物细胞中一类长度约为18—24核苷酸的内源性非编码小分子RNA。它由DNA转录产生，但并不翻译蛋白质，而是在蛋白质合成中起调节其他基因的功能，是调控其他蛋白质编码基因的基因。它通过非特异性结合位点的作用，可以对多个基因经行一对多、多对一的调控作用。因此，对miRNA特别是成家族的miRNA的检测较之单个基因的检测，在肿瘤的烟酒及之中更具前瞻性意义。miR．200家族是近年来研究的热点，mi

5、R．200a作为miR-200家族(包括miR．200a，miR-200b，miR-200c，miR-114，miR-429)的一员在多种肿瘤中表达下调，主要通过调控上皮．问质转化(epithelial．mesenchymaltransition，EMT)过程，对肿瘤的侵袭、转移起关键作用。本课题组在前期的工作中对miR-200a在结直肠癌新鲜组织中的表达进行了小样本量的检测。检测结果表明，miR-200a的表达与结直肠癌的分化程度具有相关性。在结直肠癌细胞中的检测表明miR一200a可以调控细胞的EMT现象。在前期工作的基础上，为了

6、深入了解miR．200a在结直肠癌侵袭转移的分子机制，探寻miR-200家族启动子区域甲基化与结直肠癌浸润转移之间的关系，拟进一步进行如下研究。研究内容：1．检测HCTll6、HT29、LSl74t、SW480、SW620、Lovo这6株细胞中miR一200家族启动子甲基化状态，分析其与临床分期、分化程度及预后的相关性；同时进行miR-200家族甲基化程度与患者生存相关与分析；2．对HCTl16、HT29细胞使用抑制miR一200a处理，对SW620、Lovo细胞使用过表达miR-200a处理，检测miR．200a表达量改变对细胞运动

7、转移能力和DNMTl表达的影响；TT硕士学位论文3．对HCTll6、HT29细胞使用抑制miR-200a处理，激活TGF．B通路处理，对SW620、Lovo细胞使用过表达miR-200a处理，抑制ERK通路，通过免疫印迹方法检测通路中标志物T13RII、P—ERK表达量，探讨miR-200a对DNMTl调控的作用机制。4．在HCTll6、HT29、SW620和Lovo四株细胞中分别下调和上调miR-200a，检测TGF．D1表达量，并通过生物信息学分析，寻找miR．200a与TGF-p通路可能存在的调控靶点。结果：1．BSP方法检测结

8、果显示，六株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR一200家族启动子甲基化程度不同，并且其甲基化程度与细胞恶性程度成反比，与细胞株中miR．200a表达量的检测结果一致。MSP方法检测显示，在138例结直肠癌组织中miR-