槲皮素金属配合物抗肿瘤作用及其与dna相互作用机理的研究

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1、StudyonMechanismofTumorCellAPoPtosisInducedbyQuercetinMetalComPlexesandInteractionofComPlexeswithDNAAThesisSubIulttedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofDoctorofEngineeringbyTanJunSuPervisor:Prof.W妞ngBochuMajor:BiomediealEngineeringCollegeofBioengineeringo

2、fChongqingUniversity，Chongqing，China.SePtember，2007⑥20071’anJun中文摘要摘要恶性肿瘤现已成为人类死亡的主要原因之一，寻找抗肿瘤药物己经成为药学研究的重大课题。近年研究表明某些榭皮素金属配合物不但抗氧化活性比棚皮素强，而且其抑制肿瘤细胞生长的作用也比棚皮素强。然而目前榭皮素金属配合物抗肿瘤的作用机制还不清楚。它们能否诱导肿瘤细胞凋亡，其信号转导通路，作用靶点等科学问题还有待探索研究。本课题利用生物化学、细胞生物学、药学、计算化学等多学科交叉手段，主要研究了棚皮素金属配合物(Mn、CO、Ni、Cu、Zn)对肿瘤细胞凋亡

3、的影响，及其与DNA结合和催化DNA断裂作用，探讨了棚皮素金属配合物诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制及其与DNA相互作用的机理。得到了如下结论:①采用MTT法、荧光染色法、流式细胞术和免疫细胞化学方法对棚皮素金属配合物抗肿瘤活性和诱导HePGZ细胞凋亡进行了研究，初步探讨了棚皮素金属配合物诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。l)结果表明棚皮素金属配合物(Mn、Co、Ni、Cu、Zn)对肝癌细胞HepoZ、SMMC一7721和肺腺癌细胞A549的生长均有明显的抑制作用，并呈明显的剂量和时间依赖性。其中棚皮素锰、镍和锌配合物对肿瘤细胞生长的抑制作用明显强于配体棚皮素，它们作用于HepGZ细胞4

4、8小时的半数抑制浓度Ic50分别为20.64、14.44和lo.67umol·L一’，而棚皮素的Ic50为33.69林mol·L一，。2)形态学观察结果表明HePGZ细胞经棚皮素锰、镍和锌配合物处理后，染色质凝聚，且有明显的凋亡小体出现，表明棚皮素锰、镍和锌配合物能诱导HePGZ细胞凋亡。3)细胞周期分析结果表明棚皮素锰、镍和锌配合物对肝癌HePGZ细胞生长的抑制作用可能是通过使细胞阻滞于G夕Gl期，使细胞DNA合成速度降低，细胞周期的循环被抑制而实现的。对G声1期细胞阻滞可能是配合物诱导HePGZ细胞凋亡的一个重要机制。4)免疫细胞化学检测结果表明榭皮素锰、镍和锌配合物诱导

5、HepGZ细胞凋亡可能通过下调bel一2和survivin，上调p53，引发caspase的级联反应，从而激活caspase一3来进行的。下调survivin和bcl一2的表达对棚皮素金属配合物诱导HePGZ细胞凋亡既起到了协同作用，又起到了互补作用。②采用紫外光谱法、荧光光谱法和粘度法研究了棚皮素锰、钻、镍、铜和锌配合物与小牛胸腺DNA的结合方式，采用凝胶电泳法、脱水丙二醛分析和T4连接实验较系统地研究了棚皮素锰、钻、镍、铜和锌配合物对质粒pBR322DNA的催化断裂情况。初步探讨了棚皮素金属配合物和DNA的作用方式及其对DNA的催化断几重庆大学博士学位论文裂机理。发现棚皮

6、素金属配合物具有核酸酶类活性。1)棚皮素锰、钻、镍和锌配合物仅以插入方式与DNA结合，而棚皮素铜配合物与DNA的结合方式可能不止一种，除插入方式结合以外还受到静电作用的影响。2)棚皮素锰、钻、镍、铜和锌配合物均能有效断裂DNA，且棚皮素铜配合物断裂DNA的能力最强;对于棚皮素锰、镍、铜和锌配合物，低离子强度促进DNA裂解，高离子强度抑制DNA裂解;离子强度增大能促进栅皮素钻配合物对DNA的断裂，所以棚皮素金属配合物对DNA的断裂作用受离子强度的影响。3)如以超螺旋DNA为底物，棚皮素锰、钻、镍、铜和锌配合物催化断裂DNA的反应符合准一级反应速率定律。其速率常数分别为1.18x

7、l丫S一‘、o.53xl丫s一，、0.76xl0一s一l、4.82x10一s一l、l.68x10一s一l。4)DNA断裂机理实验表明棚皮素锰、钻、镍和锌配合物均能以水解途径断裂DNA;棚皮素铜配合物以氧化还原途径断裂DNA，可能与cu(DoOH物质有关。③引入量子化学和分子力学方法，对棚皮素金属配合物抗肿瘤作用的机制及其与DNA结合作用的机理进行了理论解释。1)对棚皮素金属配合物结构进行了量子化学计算，通过对其几何构型的讨论，发现棚皮素金属配合物的6个配位氧原子与金属离子形成畸形六配位八面体配合物，其配