深海乳酸菌代谢产物保护Caco-2细胞紧密连接的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150208394上海海洋大学硕士学位论文深海乳酸菌代谢产物保护Caco-2细胞紧密题目：连接的研究TheProtectiveEffectofMetabolitesofLacticAcid英文题目：BacteriaIsolatedfromDeepSeawaterontheTightJunctionsofCaco-2Cells专业：食品科学与工程研究方向：海洋生物制药姓名：刁小真指导教师：吴文惠教授、今田千秋教授二O一八年三月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，

2、崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

3、用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员委员委员委员委员秘书答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文深海乳酸菌代谢产物保护Caco-2细胞紧密连接的研究摘要人体肠道屏障与健康息息相关。作为肠粘膜层至关重要的一部分，肠上皮不仅可以吸收对人体有益的物质和营养成分，还为其提供了有效抵御外界侵害的屏障。肠上皮由多种肠道上皮细胞构成，而在这些细胞之间存在着一些

4、连续的，相对不可渗透的被称为紧密连接（TJs）的动态结构。由多种功能性蛋白组成的紧密连接，通过调节肠上皮细胞间通透性来保护宿主免受有害分子、细菌、病毒和其他病原体的侵入。作为肠道上皮细胞的一种，Caco-2细胞在特定培养条件下，经过分化和极化，可以在细胞培养小室的滤膜上形成一层融合的单层膜。因此，Caco-2细胞可以用于评估紧密连接的功能和结构完整性。通常，跨上皮细胞电阻（TEER）的测量用于评价肠上皮细胞模型的屏障功能。虽然，现存很多关于包括植物乳酸杆菌（L.plantarum）在内的陆源性乳酸菌对于人体健康有促进作用的研究成果，但海洋环

5、境由来乳酸菌的功效却鲜有报道。在深海等极端环境下能够存活的细菌很可能发展出比陆源性菌株更加优良的相应特性。本研究旨在通过Caco-2细胞构建的肠上皮细胞模型来研究自深层海水分离得到的乳酸菌对于紧密连接的作用。近年来，由于不健康的生活习惯例如过量饮酒以及高能量的西式餐饮，许多人深受各种胃肠疾病的困扰。这些社会现状表明，本研究具有实用价值——通过摄入含有乳酸菌及其代谢物的饮食来保障肠道健康。本研究所用的菌株是从静冈县伊豆-赤沢海域800米深层海水中提取分离得到的L.plantarumBF1-13菌株。通过使用Caco-2细胞构建肠上皮细胞模型以

6、及模型优化来评价L.plantarumBF1-13菌株对于紧密连接屏障功能的功效。在24孔微量培养板中，Caco-2细胞被接种到细胞培养小室(Millicell)，当达到细胞融合时可以形成单层膜。由Millicell-ERS(Merck)测量得到的TEER值通过温度校正数学模型校正后表示为温度校正TEER（tcTEER）值。等肠上皮细胞模I上海海洋大学硕士学位论文型完成后，首先分别研究甲醇和过氧化氢两种损伤诱导剂（DI）的影响。同时，作为阳性对照（PC）的槲皮素（QU）也被确定来完善细胞模型。经过优化，相比于Caco-2细胞构建的传统21天

7、细胞模型，本研究中肠上皮细胞模型的完成时间大大缩短，在接种之后5到11天可以形成完整的单层膜。研究得到，样品培养所用的MRS液体培养基对于tcTEER值没有显著影响。100μMQU用作PC，在加入2小时后提高15%的初始tcTEER值。对于DI，甲醇会改变细胞培养小室的滤膜孔径从而造成tcTEER值的改变。相反，1mM过氧化氢在加入2小时后降低大约30%的初始tcTEER值，适合用作本研究的DI。最后，根据对照组与样品上清液组的最终tcTEER值之间的差别可以得出，L.plantarumBF1-13菌株培养上清液可以缓解经由过氧化氢氧化诱导

8、造成的屏障功能损伤；甚至在高浓度（10%）情况下对此损伤具有抑制作用。关键词：乳酸菌，深层海水，Caco-2细胞，紧密连接（TJs），跨上皮细胞电阻（TEER）II上海海洋大学硕