亚甲基蓝在日本鳗鲡体内代谢和残留消除规律研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150104133上海海洋大学硕士学位论文亚甲基蓝在日本鳗鲡体内代谢和残留消除规律研论文题目：究Metabolismandeliminationofmethylenebluein英文题目：Japaneseeel(Anguillajaponica)专业：临床兽医学研究方向：水生动物医学姓名：吕新美指导教师：杨先乐教授二〇一八年六月上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注房文红薛晖王国良答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文亚甲基蓝在日本鳗鲡体内代谢和残留

2、消除规律研究摘要亚甲基蓝是一种噻嗪类染料，在水产养殖过程中常被用作孔雀石绿和硝基呋喃等禁用药物的替代物，作为杀菌剂和解毒剂使用，用来治疗水霉病、小瓜虫病、红嘴病以及亚硝酸盐中毒。虽然日本的肯定列表和欧盟的指令等一些法规暂时并没有把亚甲基蓝列为禁用药物，但是国外的一些研究表明，亚甲基蓝具有高毒、致畸、致癌、致突变的作用。由于其大量使用、滥用，对养殖的水产动物造成了一定的毒副作用。所以美国、日本等国家未允许亚甲基蓝在水产养殖中的使用。日本规定亚甲基蓝的最大残留限量是10μg/kg，而欧盟制定的其作为消毒剂使用的最

3、终浓度为0.4mg/kg。中国并没有规定亚甲基蓝在水产品中的残留限量。目前关于亚甲基蓝的研究主要是其在人类医学中的应用和在环境污染中关于亚甲基蓝的吸附等，而关于亚甲基蓝的药代动力学研究很少，而且大部分是关于亚甲基蓝在哺乳动物中的残留消除规律的研究，在水产养殖中仅仅是研究亚甲基蓝或亚甲基蓝及其代谢物的检测方法。本文建立了高效液相色谱亚甲基蓝及其代谢产物（天青A、天青B、天青C）的检测方法，并对高效液相色谱仪的检测波长、流动相等仪器条件、前处理方法进行了优化，提高了亚甲基蓝及其代谢产物（天青A、天青B、天青C）在

4、组织中的提取率，为研究其在日本鳗鲡组织中的残留消除规律奠定基础。在亚甲基蓝的药浴浓度为10mg/L和20mg/L的条件下，用建立的亚甲基蓝及其代谢产物（天青A、天青B、天青C）检测方法测定日本鳗鲡血液及肝脏、肾脏、皮肤、肌肉组织中亚甲基蓝及其代谢产物（天青A、天青B、天青C）的含量，用DAS3.0药动学软件分析药时数据。实验结果表明天青C在血液及各组织中均未被检测出。10mg/L药浴浓度组，亚甲基蓝、天青A、天青B在日本鳗鲡血浆中的达峰时间分别为0.25、8、0.25h，达峰浓度分别为205.6、15.8、1

5、60.4μg/L。20mg/L药浴浓度组，亚甲基蓝、天青A、天青B在日本鳗鲡血液中的达峰时间分别为0.5、12、0.5h，达峰浓度分别为435.7、35.7、340.3μg/L。日本鳗鲡肝脏、肾脏、皮肤、肌肉组织中的亚甲基蓝、天青A、天青B浓度水平的数据表明，无论是10mg/L药浴浓度组还是20mg/L的药浴浓度组，亚甲基蓝、天青A、天青B在日本鳗鲡四种组织中的最高浓度顺序均为肾脏>肝脏>肌肉>皮肤。在药浴浓度10mg/L条件下，亚甲基蓝、天青A、天青B在日本鳗鲡肝脏、肾脏、皮肤、肌肉组织中的消I上海海洋大学

6、硕士学位论文除半衰期、达峰时间都显著的快于20mg/L药浴浓度组。实验还发现，不同的亚甲基蓝的药浴浓度，其在日本鳗鲡肝脏、肾脏、皮肤、肌肉组织中的代谢规律是基本相似的，均是随着药浴浓度的升高，各组织中亚甲基蓝、天青A、天青B的浓度均是随时间的延长呈先升高后降低的趋势。本文还运用转录组学方法在一定程度上从分子水平上阐述了亚甲基蓝在日本鳗鲡组织中的代谢机制。构建了日本鳗鲡肝组织cDNA文库通过高通量RNA测序得到亚甲基蓝药浴后的日本鳗鲡的差异表达基因，共获得28,850个，其中上调的差异表达的基因23,032个，

7、下调的差异表达的基因5,818个。然后将差异表达的基因进行GO富集分析、KEGGpathway富集分析，qPCR验证，结果表明，差异表达的基因主要参与的代谢通路有物质能量代谢通路如：柠檬酸循环，碳代谢、嘧啶代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等；药物代谢通路，主要是药物代谢酶细胞色素P450酶；异物的化学致癌作用，如：转化生长因子-β信号通路（TGF-betasignalingpathway）、WNT信号通路、Jak-STAT信号通路，GnRh信号通路等。这些通路都是参与细胞凋亡的过程。本实验通过转录组学方法解析亚甲基

8、蓝在日本鳗鲡组织中的代谢途径，为亚甲基蓝代谢机理的阐明提供了理论的参考。关键词：亚甲基蓝;天青A;天青B;天青C；残留消除规律;转录组II上海海洋大学硕士学位论文MetabolismandresidueeliminationofmethyleneblueinJapaneseeel(Anguillajaponica)ABSTRACTMethyleneblue(MB)isathiazinedye.Ina