重力自平衡自由流电泳装置的研制与应用

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1、上海交通大学硕士学位论文重力自平衡自由流电泳装置的研制与应用DEVELOPMENTOFANEWPREPARATIVEFREE-FLOWELECTROPHORESISAPPARATUSWITHSELF-BALANCECOLLECTORBASEDONGRATISGRAVITYANDINVESTIGATIONOFITSAPPLICATION(申请理学硕士学位)硕士姓名：杨成章专业：生物学学号：1110809053研究方向：生物分离与分析指导导师：樊柳荫(副教授)上海交通大学生命科学技术学院2014年02月1万方数据万方数据万方数据上海交通大学硕士学位论文

2、摘要重力自平衡自由流电泳装置的研制与应用摘要自由流电泳（freeflowelectrophoresis,FFE）指具有电荷差异的待分离混合物随液相背景缓冲液（carrierbuffer,CB）通过多通道泵输入由两块绝缘板构成的薄腔后，受到垂直于液体流动方向的不同大小的电场力，实现分离分析的电泳技术。FFE具有操作连续、分离模式多样、无固体支持介质、分离条件温和等特点，既可以用做制备工具，也可以作为分析检测工具。比较大型的FFE装置常用于制备研究，而微流控芯片级FFE（microfluidicFFE,μFFE）常用来对物质进行分析检测。可以说，自从德

3、国科学家Sevsson在1949年首次提出FFE原型以来，有关FFE的研究从未停止。FFE凭着自身强大的优势，已经在小分子（无机或有机化合物）、大分子（多糖、多肽、蛋白质、核酸）、（亚）细胞等对象的分离分析上得到了很多应用。随着科技的发展、技术的进步，FFE技术在多年的发展历程中也不断成熟，各种商业化的FFE仪器也出现在市场上。最早型号的ElphorVap21FFE装置于1994年由Bender&Hobein研制成功，并被用作多种生物样本的制备。随后，德国科学家GerhardWeber对装置进行改进，研发了新一代的FFE，并专门成立了FFEServ

4、iceGmbH公司在全球范围内提供专门的FFE服务。后来，美国医疗器TM械巨头BD公司也研制了BDFFE型号的FFE仪器并将其投入市场，授权北京博奥生物有限公司为中国地区的独家代理。然而，一台进口FFE仪器售价在120~140万人民币，非常昂贵，限制了FFE技术的推广应用。中国对于FFE的重视程度与国外相比，仍相距甚远。到目前为止，国内并没有具有自主知识产权的商业化FFE问世。国内做FFE研究方向的科学家也为数不多，对FFE的重视程度尚显不足。国内较为引人注意的FFE样机是20世纪80年代末研制的A3-2型FFE仪器，当时在神州四号飞船上对细胞色素

5、C（cytochromeC,CytC）和牛血红蛋白（hemoglobin,Hb）进行过失重电泳分离实验，但并没有商业化。生物分离与分析实验室作为国际上FFE研究方向的佼佼者，自2009年以来4万方数据上海交通大学硕士学位论文摘要一直在尝试国产FFE仪器的商业化，成功研制出基于重力自平衡原理的FFE装置，并在国际上首次提出移动反应界面自由流电泳（freeflowmovingreactionboundaryelectrophoresis,FFMRBE）概念，将FFE技术与移动反应界面原理相结合。该FFE装置被成功应用于吩嗪-1-羧酸（phenazine

6、-1-carboxylicacid,PCA）的分离纯化、蛋白质和细胞的分离。然而，该实验室研制的FFE也存在一些问题，比如：（1）装置操作很不方便；（2）容易漏液；（3）外形丑陋，距离商业化仪器的标准甚远。因此，本论文的研究内容就是针对旧FFE装置存在的问题进行改进，力争研制出达到商业化标准的低成本国产FFE装置，同时也对装置的性能进行了全方位的检测，并将新一代的FFE应用到蛋白质、细胞的分离。研制出的新型FFE装置包括4部分：（1）自动化的电路集成系统（包括输液系统、散热系统、温控系统、供电系统）；（2）气液缓冲器（gascusioninject

7、or,GCI）（具备排气泡功能）；（3）分离室（分离腔体积为45mm*120mm*0.6-0.8mm，12个进口、24个出口）；（4）自平衡回收装置（self-balancecollector,SBC）。实验表明，装置具备优良的性能，整体设计上基本符合商业化FFE仪器的标准。Ω曲线实验和气泡产生实验表明装置具有很好的散热效果，在使用10mMpH8.0Tris-HCl背景缓冲液（carrierbuffer，CB）（电导率为720μS·cm-1）、50mMpH8.0Tris-HCl电极缓冲液（electrodebuffer，EB）（电导率为2530μS

8、·cm-1）的条件下，最大可施加电压为400V，不散热条件下的电流较之散热条件下的电流高-5.30%~70.26%。在散热