原发性肝癌组织中ezrin与cullin-1的表达及其临床病理意义

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1、硕士学位论文第二章材料与方法2．1临床资料收集中南大学湘雅二医院肝胆胰外科2001年3月至2006年11月原发性肝癌手术切除标本40例(术前均未进行化疗和放疗)。男性32例(80．00％)，女性8例(20．00％)；年龄28-、．73岁，平均年龄(49．28士12．58)岁；病理学类型包括肝细胞性肝癌(HCC)34例(85．00％)、胆管细胞性肝癌(CC)3例(7．50％)、混合型肝癌(MHC)3例(7．50％)：分化程度：高分化4例(10．00％)，中分化18例(45．oo％)，低分化18例(45．00％)i血清乙肝全套测定慢性乙肝35例

2、(77．50％)；血清AFP定性定量测定AFP<30pg／L11例(27．50％)，AFP30—1000“g／L26例(65．oo％)和AFP>1000熠几3例(7．50％)；术前血清肝癌特异性蛋白(SHCSP)阳性9例(22．50％)和阴性31例(77．50％)I术中或病理证实肝硬化无或轻度23例(57．50％)，肝硬化中至重度17例(42．50％)I术中或病理证实肝内转移24例(60．00呦，无转移16例(40．00％)；有癌栓14例(35．00％)，无癌栓26例(65．00％)；大体形态包括巨块型3l例(77．50％)、结节型9例(2

3、2．50％)、弥漫型0例；肿块大d、<5cm4例(10．00％)、之5cm36例(90．00％)。所有病例癌肿均手术切除。切除标本均取癌组织及癌旁组织(距肿块lcm处)，同时另单独取10例经病理证实的正常肝脏组织(来源于肝破裂患者切除的肝脏)作为对照。标本经10％中性福尔马林固定后常规制作石蜡包埋连续切片，切片厚41xrn。2．2主要试剂兔抗人Cullin．1基因蛋白多克隆抗体，鼠抗人Ezrin基因蛋白单克隆抗体均购于福州迈新生物技术开发有限公司，抗兔／鼠通用型免疫组化检测试剂盒(ChemMateEnVisionrM+／HRP／DABRb&

4、Mo)购自基因科技(上海)有限公司，丹麦Dako公司分装产品。2．3Ezrin和Cullin．1表达的检测方法Ezfin和Cullin．1染色方法均YgEnvisionTM免疫组化法，具体步骤：1．DAB工作液的配制：临用前，按每毫升B液(DAB稀释液)中加1滴(或20微升)C液(DAB原液)的浓度配制所需要的用量，混匀后备用。2．切片常规脱蜡水化：将已在70。C烤箱中烤过的石蜡切片浸于二甲苯中10分钟×3次。取出切片置于100％无水乙醇中20分钟×2次；依次置入95％和80％酒精中各20分钟，取出置于蒸馏水中。3．ChemMateEnVi

5、sionTM+／HRP／DAB，兔／鼠二步法染色：2硕士学位论文第二章材料与方法1)取出蒸馏水中的切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂(3％过氧化氢)于组织上避光孵育lO分钟，用蒸馏水冲洗。2)将切片置入EDTA消化液(O．125％，pH9．0)15分钟，先后用自来水、蒸馏水冲洗。再将切片置入O．Olmol／LPBS缓冲液(pH7．4)中，浸泡5分钟×3次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。3)滴加50微升一抗(抗小鼠)工作液于组织上，室温孵育60分钟。用O．Olmol／L

6、PBS缓冲液(pH7．4)浸泡切片5分钟×3次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。4)滴加50微升A液(ChemMateEnVisionTM+／HI心)于组织上，室温孵育30分钟。用O．Olmol／LPBS缓冲液(pH7．4)浸泡切片5分钟x3次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。5)滴加预备好的显色剂DAB工作液50微升，室温孵育15分钟，或光镜下控制显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。6)苏木精复染1分钟，自来水冲洗15分钟。7)各级酒精(80％，95％，100％)脱水

7、，每级2分钟。取出切片置入二甲苯中透明10分钟。8)用中性树胶封片以试剂盒中阳性切片作为染色的阳性对照，以PBS液(pH7．4)替代一抗作为染色的阴性对照。结果判断：细胞膜或(和)细胞核中含黄色至棕黄色颗粒者为阳性细胞。评分参照许良中【9】报道的方法：分别计数10个高倍镜视野下的阳性细胞，(无，O分；弱，1分：中，2分；强，3分)和表达阳性率评分(<5％，0分；5％～lO％，1分；10％～20％，2分；20％～50％，3分；>50％，4分．)之和为该病例表达评分；将评分0"2分定为阴性病例，>3分定为阳性病例。4统计学处理将所得数据输入SP

8、SS11．5统计软件包进行t检验、f检验和sp鲫nnl锄秩相关分析。检验水准a=0．05。硕士学位论文第三章结果3．1Ezrin在PHC中的表达Ezrin蛋白在PHC癌组织及癌旁