plastin在子宫内膜异位症患者在位内膜及异位病灶中的表达及意义

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1、18490212，编码蛋白：人plastin2(L—plastin)，mRNA(cDNA克隆MGC：23890IMAGE：4730117)。大量的研究表明，T-plastin是一种与细胞骨架的调节相关的微丝交联蛋白，其作用包括稳定肌动蛋白丝，调节肌动蛋白组成及动力学乜1，并保护肌动蛋白丝避免eofilin介导的解聚作用，促进移行的成纤维细胞前缘处丝网的稳定。而L-plastin作为一种恶性转化相关蛋白，通过对肌动蛋白及原肌球蛋白表达的有效调节，甚至是通过引起相关的肌动蛋白突变嘲，显著调节微丝系统细胞质内形成过程变化‰射，从

2、而使微丝系统的稳定性下降；且其启动子上存在一个雌激素受体半结合位点，受雌激素明显上调呦。这些均提示其两者可能通过影响子宫内膜细胞的浸润、侵袭及被激素调节而在子宫内膜异位症的发生、发展中发挥重要的作用。本研究应用原位杂交方法检测候选基因T-plastin及L-plastin在内异症在位内膜及异位病灶中的表达，并对其表达水平与月经周期进行相关性分析，验证eDNA．RDA所筛查出的差异基因在子宫内膜异位症中的意义。通过研究差异基因的表达，以期待发现影响子宫内膜异位症发生、发展的特异性靶基因。材料与方法一、标本来源组织采自2007

3、年5月至2007年12月间在中国医科大学附属盛京妇产科的患者，共计58例。实验组：选取经病理证实的内异症患者的在位内膜36例，其中标本采自增殖期者17例，采自分泌期者19例；年龄为29—49岁，平均年龄39．114-5．47岁；并取同组病人的异位病灶。对照组：非内异症患者在位内膜：因CINII一Ⅲ行开腹手术或腹腔镜手术，证实盆腔结构正常的妇女22例，其中标本采自增殖期者9例，标本采自分泌期者13例；年龄27—49岁，平均年龄41．22±5．10岁。所选病例均无其他免疫疾病、急性炎症，术前3个月内未接受激素治疗。各组年龄之间

4、差异无显著性意义(P>0．05)。且各研究组中患者月经周期构成比的差别没有统计学意义(产0．0297，P>0．05，n=58)，即本研究中月经周期造成的抽样误差不会影响不同研究组之间的差别。二、实验方法7(一)标本处理实验组与对照组病例均于非月经期接受手术，在术中收集标本。取得标本后，尽量冲洗尽所附血液，于4％的多聚甲醛／o．1MPBS(PH7．0-7．6)中固定4—6小时，常规石蜡包埋，用于进行原位杂交的检测。(二)探针制作针对T-plastin及L—plastin靶基因的mRNA探针序列，由博士德生物工程(武汉)有限公

5、司合成。序列见表1。表1，T-plastin和L．plastin的探针序列名称原位杂交探针(5’一3’)T-plastm(1)CTTCATGAGCTCTTCAAGGAAGCTAATATGCCATT(2)AAATTAACAACTTTAGTGCTGACATCAAGGATTC(3)GATATTAACATGTCAGGTTTCAATGAAACAGATGAL-pl嬲tm(1)GATGGCAATGGATACATCAGCTTCAATGAGTTGAA(2)GCAAC氏氏氏缸TGGCAACTTCAGTACTGACATCAAG(3)GACATG

6、TCAGGACTGCGGGAGAAGGATGACATCCA(三)T-plastin及L．plastin标记及显色——原位杂交技术①制片：玻片经多聚赖氨酸处理，石蜡标本经酒精、二甲苯常规脱蜡至水，应用30％H202恒温箱37。C处理20分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗三次。②暴露mRNA核酸片段：切片滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(0．5m13％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，恒温箱37。C消化5分钟，PBS洗3次木5分钟。③预杂交：每张切片加预杂交液20m，恒温箱37。C4小时。④杂交：每张切片加杂交液40m，并将原位杂

7、交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱37℃过夜。8：⑤杂交后洗涤：37。C的2*SSC洗涤5分钟木2次，37。C的0．5*SSC洗涤5分钟木1次，37℃的0．2*SSC洗涤5分钟木1次。⑥滴加封闭液，恒温箱37℃30分钟。⑦滴加试剂：滴加生物素化鼠抗地高辛，恒温箱37。C60分钟，PBS洗5分钟木4次；滴加SABC，恒温箱37"C20分钟，PBS洗5分钟木3次；滴加生物素化过氧化物酶，恒温箱37℃20分钟，PBS洗5分钟，Ic4次。⑨DAB显色及封片：使用DAB显色试剂盒，Iml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混

8、匀，加至标本上。恒温箱37"C显色30分钟，苏木素复染15秒，酒精脱水，二甲苯透明，封片。(四)结果判定光学显微镜下观察结果的判定标准：阳性对照：由博士德公司提供试剂盒中提供阳性对照。空白对照：选取未加入探针的子宫内膜标本呈现的阴性染色为空白对照。在本研究中，原位杂交染色以腺上皮细胞胞浆内出现黄色和棕黄