小麦抗条锈病新基因材料ssh+cdna文库的构建及初步筛选

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1、及生化特征，比如产生DNA梯度片段化(DNALaddering)和TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyltransferase．mediatedUTPendlabeling)阳性反应，能够检测到c嬲pase．1ike蛋白裂解酶活性和Ca2+依赖核酸酶等(Dangleta1．，1996；Heath，1998；Nilrnbergereta1．，1997：RyersonandHeath，1996)。在HR过后的几小时甚至几天内，通常会伴随SAP,的发生，即在远离病原物侵染部位的组织中也会相继激活防御反应，对后续其它病原物的入侵产生广谱的抗性(Delaney，19

2、97；Ryalseta1．，1996)。1．3尺基因的克隆及其结构特点R基因的成功分离主要得益于图位克隆法(map—basedcloning)和转座子标签技术(transposontagging)的发展和完善。自1992年从玉米中克隆到第一个只基因——抗圆斑病基因Hml以来，人们已经在多种单子叶和双子叶植物中分离得到40多个针对真菌、细菌、病毒和线虫的抗病基因(表1-1)。虽然这些病原物的生活史以及致病机理有很大的不同，但是已经克隆的尺基因编码的蛋白却具有一些保守的结构域，它们在与病原物产物的互作以及防卫反应的激活过程中起着重要的作用，主要有核苷酸结合位点('Nucleotid

3、eBindingSite，NBS)、富亮氨酸重复(Leucine．richRepeat，LRR)、丝氨酸／苏氨酸激酶(Serine．ThreonineKinase，STK)、跨膜结构域(TransmembraneDomain，TM)、亮氨酸拉链(LeucineZipper，LZ)以及果蝇toll蛋白及哺乳动物白细胞介素．1受体(TollandIntedeukin．1Receptor，TIR)的胞外相似区域(Youngeta1．，2000)等。几乎所有的R蛋白均包含LRR结构域，它包括一个重复序列模体(motiO，由亮氨酸残基以及半保守的天冬氨酸和脯氨酸残基组成(KobeandD

4、eisenhofer，1994)。不同R基因编码蛋白的平均重复长度为24个氨基酸，然而重复数量可以从RPS2的12个多至印的37个。根据LRR亚细胞定位的不同，R蛋白可以被分为两类：一类是胞内R蛋白，由胞内LRR、NBS和LZ或者TIR、CC等结构域组成。大多数尺基因编码蛋白中心结构域由NBS组成，能够结合ATP或者GTP，C．末端是一系列不同数量的LRR残基，依R蛋白不同各异。这些R基因在单子叶植物和双子叶植物中组成了一个超家族被称为NBS．LRR基因。NBS．LRR蛋白更进一步划分为两个亚群：N一末端具有TIR结构域的TIR-NBS．LRR蛋白和不具有TIR结构域却通常以C

5、C(Coiled·Coil)结构域取而代之的CC-NBS．LRR蛋白。目前的研究发现，单子叶植物中只鉴定出CC．NBS—LRR基因而双子叶植物中两者皆有但TIR．NBS．LRR基因占多数，这是单子叶植物和双子叶植物间最主要的区别。NBS．LRR蛋白一般存在于细胞质中，但是至少有一种与质膜相关(Boyeseta1．，1998)。另一类是胞外R蛋白，由胞外LRR、TM和／或蛋白激酶等结构域组成。胞外LRR(extracellulaxLRR，eLRR)通常带有跨膜区域，并且有些与细胞质内的蛋白激酶结构域偶联。猪RNA酶抑制剂是一种具有LRR结构域的蛋白质，它的晶体结构现已被解析(Ko

6、beandDeisenhofer，1993)。在这个蛋白质的三级结构中，LRR结构域的重复长达28—29个氨基酸，形成类似马蹄状的结构。这种马蹄形的结构很可能和R基因编码蛋白具有的更短的重复不同(JonesandJones，1996)，这种更短的重复有可能形成线性棒状的结构。推测胞外LRR有一个保守的疏水表面作为支撑结构，同时另一边不保守的侧链氨基酸残基形成裂缝结构，能够与特异的配体发生相互作用(ParniskeandJones，1999；Thomaseta1．，1998)。LRR结构域介导的蛋白质与蛋白质之间的相互作用(KobeandDeisenhofer，1994)在级联信

7、号传递或者作为激素受体方面(Moyleeta1．，1995)起着重要的作用。植物R蛋白LRR结构域特异残基的突变表现出抗性的缺失或者特异性改变，例如RPS2、RPMl和Ⅳ的变化引起植物体对无毒致病菌的HR激活失常。除此之外，LZ和TIR结构域也具有类似的作用。4＼oI笛l2雏l专I≈l喜l厶l副=堇茎悖l薹l芒I￡旧暑J∽I譬I∞￡lZ荡J＆I；{如笛I配{’如苫I号羞f之小口△_，飞奄sIIIIIoU∞岔小_．奄奄sJQ高Q苫oooN．．7毽≈苦它。口卜小夺H．—飞～舢口og勺H_《n岔岔