卤醇脱卤酶C(HheC)的分子定向进化研究.pdf

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1、论文题目卤醇脱卤酶C(HheC)的分子定向进化研究学科专业生物化学与分子生物学学号201021090215作者姓名刘羽指导教师汤丽霞副教授万方数据分类号密级注1UDC学位论文卤醇脱卤酶C(HheC)的分子定向进化研究（题名和副题名）刘羽（作者姓名）指导教师汤丽霞副教授电子科技大学成都（姓名、职称、单位名称）申请学位级别硕士学科专业生物化学与分子生物学提交论文日期2013.04论文答辩日期2013.05学位授予单位和日期电子科技大学2013年06月29日答辩委员会主席评阅人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。万方数据DIRECTEDEVOLUTIONOFHALOHYDRINDE

2、HALOGENASEFROMAGROBACTERIUMRADIOBACTERAD1(HHEC)AMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaMajor:BiochemistryandmolecularbiologyAuthor:YuLiuAdvisor:LixiaTangSchool:Schooloflifescienceandtechnology万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，

3、论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：日期：年月日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后应遵守此规定）签名：导师签名：日期：年月日万方数据摘要摘要卤醇脱

4、卤酶可催化邻卤醇脱卤，生成相应的环氧化物及卤离子、氢离子，在自然界中参与许多环境污染物的生物降解。分说析序列与三级结构发现，卤醇脱卤酶与短链脱氢酶/还原酶(SDR)家族蛋白质具有一定相似性。根据序列相似度，目前已知的六种卤醇脱卤酶分为A、B、C三种。卤醇脱卤酶HheC来源于放射性土壤杆菌，已得到该酶野生型的三维空间晶体结构，并分析得到与酶促催化反应相关的催化活性三联体Arg149-Tyr145-Ser132，还发现野生型HheC可以降解芳香族或脂肪族等多种有机卤化物，并且具有明显对映选择性。尽管对HheC的研究已获得大量成果，但仍需要对其进行改造，包括扩大底物范围、增强立体选择性或

5、改变对映选择性，以适用于实际生产。目前，对卤醇脱卤酶HheC的研究主要集中在运用理性手段对HheC活性位点周围的位点进行定点突变。但是，HheC上存在其他与酶的生理活性相关但是远离活性位点的氨基酸位点，这些位点在以往的研究中并未得到重视。为了对这些位点的功能进行研究，从而得到具有更好的生化活性的突变株，本文采用易错PCR结合大引物PCR的方法构建一个低频率的随机突变文库，并利用实验室已构建的pH指示剂的高通量筛选方法对文库进行了筛选。最终得到10个活性明显提高的突变体，良性突变体的突变位点不仅有活性中心周围的位点，还有一些位点广泛分布于整个HheC分子的三级结构上，在以往的研究中并

6、未引起重视。这些突变体活性提高了110%~430%。在不同亲核试剂介导下，卤醇脱卤酶能有效催化逆反应，即环氧化物的开环，从而实现环氧化物和邻卤醇之间的转化，可生产β-取代醇等化合物。尽管目前对卤醇脱卤酶的脱卤反应有深入了解，但缺少有效的方法针对开环反应进行活性检测以及文库的大规模筛选。实验室已成功构建好利用高碘酸钠反滴定L-肾上腺素的高通量筛选体系。本文对这个体系进行了改进，不仅优化了反应条件，进行亲核试剂的选择，还确定了高碘酸钠的定量范围以及一般情况下高碘酸钠的反应浓度，另外扩大了此方法对环氧化物的筛选范围，并用气相检测验证了这一结果。这些实验成果为肾上腺素实验成功用于卤醇脱卤酶

7、催还环氧化物的开环反应奠定了重要基础，也为实验拓展到其他酶的相关应用提供了依据。I万方数据摘要关键词：卤醇脱卤酶C，定向进化，开环反应II万方数据ABSTRACTABSTRACTHalohydrindehalogenasescatalyzethedehalogenationofvicinalhaloalcohols,resultinginthegenerationofcorrespondingepoxide,ahalideion,andaproton.Theenzym