银鲫与彩鲫卵母细胞cdna文库构建及周期蛋白a1的cdna克隆

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1、()第24卷第6期水生生物学报、Tn124．No62000年11月ACTAHYDRoB10U)GICASINICANov．2000一S氇1银鲫与彩鲫卵母细胞cDNA文库构建及周期蛋白A的cDNA克隆{．％S、l1汪洋桂建芳(中国科学院水生生物研究所；淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉430072)摘要：分别取行天然雌核发育繁殖的银鲫和两性生殖的彩押的卵母细胞为材料．提取总1LNA，分离mRNA，进而反转录合成cDNA并定向插入XgtllSfi—Not克隆载体，经体外包装构建了银鲫与彩鲫卵母细胞的表达型cDNA文库。测试结

2、果表明库容量分别达到3．1×106(银鲫)和1．6×106(彩鲫)。进一步人工合成Cydin保守引物．采用PCR扩增文库的方法，克隆了银鲫(1616bp)与彩鲫(1626bp)的Cydin全长eDNA。序刊分析结果表嘎：两种鱼编码区长度均为1173bp，起始于一十包含在脊推动物起始密码子ANNATG基元内ATG的单一开放读码框．编码391个氨基酸；5’一端非编码区长度也同为70bp，3一’端非编码区长度略有不同，银鲫为373bp，而彩鲫则为383bp；二者3’一端均带有AATAAA的Poly(A)YJI~尾信号以及24bp(

3、银鲫)和27bp(彩鲫)的Poly(A)尾巴。比较银鲫、彩鲫和金鱼与人、爪蟾CyclinAl氨基酸序列同源性的结果表明，CydinA1在人、爪蟾与鱼类之间具有较高同源性；而在银鲫、彩鲫和金鱼之间，CydinA】仅在周期蛋白框外存在5十氨基酸的差异且这些差异均是由十别碱基的变异造成的。关键词：苎堕筮苴；璧璺；显熟c占；细胞周期；CydihA,中圈分类号：$965．117文献标识码：A文章编号：1000—3207(2000}06—0573—09银鲫(Carassius口“m￡gibelio)是行天然雌核发育的两性型种群。，其卵子

4、激活和发商有着不同于一般两性融合生殖的控制机制；这种特殊的生殖方式，使其成为研究鱼类卵母细胞发育、成熟和受精过程的独特研究体系。以往的研究表明：银鲫雌核发育的控制机制主要在于(1)通过抑制卵母细胞第一次成熟分裂，使卵母细胞不经减数分裂而形成成熟卵子，从而保持银鲫卵子染色体倍性不变；(2)通过抑制入卵精核的发育和两性融合，使入卵精子仅起到促使卵子发育的激动作用，精子入卵后呈致密态存在，不与卵核融合。二者共同作用，决定了银鲫雌核发育的特殊性。显然，搞清楚这两个过程的分子机制，不仅对揭示鱼类的雌核发育机制具有重要意义，并有可能揭示

5、出调控卵母细胞成熟和受精这些生命发生基本过程中的某些关键基因，有潜在的理论和应用价值。收稿日期：2000—03—04：修订日期：2090—04—30基金项目：国家自然科学基金(批准号：39700070，39730290，39823003)；国家重点基础研究项目(G1999053908)和中国科学院基础研究项目(KJ951—131607—3)资助作者简介：樊连春(196B一)，男，湖北十堰市人，博士，助理研究员研究方向：遗传学通讯作者桂建芳574水生生物学报24卷细胞周期蛋白(Cyclin)是调控真核生物细胞周期有丝分裂及减数

6、分裂过程的一个十分重要的蛋白家族J。在卵母细胞成熟过程中，Cyclin与CDK(Cyelindependentkinase)形成功能复合物，使一些有丝分裂结构蛋白磷酸化而诱导有丝分裂及减数分裂的发生本实验以雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫成熟卵母细胞为材料提纯rI1RNA反转录成eDNA，建立了两种鱼的eDNA文库。在此基础上，克隆了两种鱼CyelinA1的eDNA全长基因，以期揭示这两种生殖方式不同的鲫鱼之间CyclinA1基因是否存在差异。l材料和方法1．1mRNA的提取以D系银鲫(Carassiusaurclt~bell0，

7、Dclone，l早)和彩鲫(巳rassiusauratu$oolorvariety，1旱)成熟二龄鱼为材料(取自中国科学院水生生物研究所关桥实验场)，取繁殖季节经人工催产排出的成熟卵母细胞匀浆后参考Pharrrmcia公司总RNA提取(Cat．27—9270—01)及retiNA纯化产品(Cat27—9258—01)说明，提取总RNA及mRNA，通过电泳及紫外分析检测f『A的质量和浓度。1．2eDNA的合成参照Pharmaeia公司Time,avereDNASythesisKit(Cat．27～9262—01)说明，以mRN

8、A为模板，加入带NotI酶切位点的寡聚(T)为引物，合成eDNA第一链；再加入E．cotiRNase，E．coliDNA聚合酶I以及E．coliDNA连接酶，在这一步骤中将去除mRNA模板并合成eDNA第二链；由此得到的双链eDNA分子在T4聚合酶作用下补平末端，并连接EcoRI定向衔接头