β-catenin与大鼠慢性心肌缺血所致心肌重构关系的研究

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1、http://www.paper.edu.cnβ-catenin与大鼠慢性心肌缺血所致心肌重构1关系的研究12111111，3王玉平，张勇，杭鹏洲，赵金龙，纪红蕊，王莉安，毕辉，杜智敏1哈尔滨医科大学临床药理教研室，哈尔滨（150081）2哈尔滨医科大学药理教研室，哈尔滨（150081）3黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，哈尔滨（150081）E-mail:dzm1956@126.com摘要：目的研究β-catenin在大鼠心肌缺血所致心律失常时的变化，探讨其与心机重构的关系及机制。方法结扎大鼠左旋冠状动脉前降支建立心肌缺血模型，取心脏

2、组织，并分别用Westernblot和免疫荧光法观察β-catenin随着缺血时间的延长蛋白表达的变化。同时建立胆碱干预的急性心肌缺血模型，在缺血前15miniv胆碱10mg/kg,用Westernblot检测胆碱对β-catenin表达的影响。结果随着缺血时间的延长，β-catenin表达增加，且在急性心肌缺血模型中的胆碱组β-catenin的表达高于缺血组。结论β-catenin参与了慢性心肌缺血所致的心肌重构，其作用可能是由于缺血本身激活了对胆碱敏感的受体，该受体直接或间接激活了β-catenin。关键词：β-catenin；心肌缺血；胆碱；心肌重构中图分

3、类号：R961.引言近来研究表明，β连环素（β-catenin）除了参与细胞间黏附外，作为Wnt信号通路的关[1,2]键因子，在心脏的早期胚胎形成及发展过程中起重要作用。有研究报道，β-catenin的稳[3]定表达能减少由于血管紧张素II长期作用所致的心肌肥厚。目前关于β-catenin在心脏上作用的研究国内报道较少，β-catenin与心肌缺血所致心肌重构及作用机制的研究还未有报道。本文通过建立心肌缺血的动物模型，用免疫印迹和免疫组化的方法阐明了β-catenin在心肌缺血中的变化及作用机制，为心脏疾病的防治提供新的药物作用靶点及临床用药依据。2.材料和方法

4、2.1材料2.1.1实验动物Wistar大鼠（雄性，250±20g），25只，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。2.1.2主要试剂抗β-catenin单克隆抗体SantaCruz生物技术公司；红外荧光标记的二抗AlexaFluor594购自MolecularProbes公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司；Westernblotting封闭蛋白干粉为博士德生物工程有限公司产品；PVDF膜为Bio-RAD公司产品；蛋白酶抑制剂、蛋白电泳液、转膜液和考马斯亮蓝染液均为华特生生物技术公司产品；胆碱由药理教研室惠赠；BSA为Amresco公司产品；

5、多聚甲醛（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心产品）；蔗糖（分析纯，天津市丽区天大化学试剂）。1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（No.20050226010）资助。-1-http://www.paper.edu.cn2.1.3仪器差速离心机为日本Hitachi公司产品；蛋白电泳仪为Bio-RAD公司产品；CM-1850冰冻切片机为Leica公司产品；免疫荧光显微镜为Nikon公司产品；Odyssey红外扫描成像系统为美国LI-COR公司产品。2.2方法2.2.1制备大鼠心肌缺血模型[4]慢性心肌缺血模型：大鼠用10%水合氯醛（30mg/kg,ip）麻醉

6、，仰卧位固定，四肢连接心电图机，记录标准II导联心电图，接呼吸机。沿胸骨左缘3～4肋间开胸，快速暴露心脏，在距左冠状动脉前降支下缘2mm处结扎，以心电图ST段明显抬高，结扎线以下心肌颜色变暗为造模成功的标志。并随机分为正常组，结扎1小时组，6小时组，1个月组，正常喂养，待达到结扎时间取材。[5]急性心肌缺血模型：正常大鼠随机分为三组：对照组，缺血组（结扎20min后取材），胆碱组（iv胆碱10mg/kg，15min后结扎，结扎20min后取材）。2.2.2免疫组化取材将造模成功的大鼠用10%水合氯醛麻醉，开胸，暴露心脏，将灌流针刺入左心室，活体灌注平衡冲洗缓冲液

7、150ml(PBSpH7.4)，速度为5ml/min，换为固定液（4%多聚甲醛）继续灌注200ml左右。小心分离灌注固定的心脏，在上述固定液中固定12小时，再经30%蔗糖脱水过夜。OCT包埋心脏组织，LeicaCM-1850冰冻切片机上冰冻切片，所切组织厚度10um。之后，进行免疫荧光标记。2.2.3免疫荧光检测组织切片首先做抗原修复，即将片子放入修复液中，于90～94℃水浴箱中加热15min,冷却至室温，PBS洗三次，5min/次；后进行组织穿透1h，穿透液（0.4%TritonX-100+1%BSA），再用5%正常山羊血清室温封闭5h，PBS洗三次，5min

8、/次，加入一抗β-cat