鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估

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1、中国科学C辑：生命科学2007年第37卷第6期：601—608《中国科学>杂志社http：／／www．scichina．comSCIENCEINCHINAPRESS鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估陈平+张丽军+李选文王细娥曹锐刘珍熊继先彭霞魏颖娟银兴峰王贤纯梁宋平4(湖南师范大学生命科学学院，长沙410081)摘要细胞质膜是细胞中重要的细胞器，在肝功能的发挥中具有非常重要的作用．使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜，通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度．结果显示，与组织匀浆成分相比，质膜富集了20倍，线粒体的污染减少了约50％．提取的蛋白质用二／一维凝胶电泳(2DE／1DE)分

2、离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI—Q—TOF)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI．TOF—TOF)鉴定，或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联电喷雾离子阱质谱(LC—LTQ)(-鸟枪法)鉴定．一共鉴定了547个非冗余蛋白质，其中34％为质膜或质膜相关蛋白质．优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法，且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的分析．关键词肝细胞质膜蛋白质组质谱2DE鸟枪法1DE肝脏是人类最大的器官，它的复杂性仅次于大究．细胞质膜通过蔗糖密度梯度离心，用3种不同的脑，肝病(如各种肝炎及肝癌等)仍然是现代医疗的巨方法(2DE—MS／MS，1DE—L

3、C—MS／MS和鸟枪法)来分离大挑战．为了解决这些问题，中国科学家牵头启动了鉴定蛋白质．一共鉴定了547个非冗余蛋白质，其人类肝脏蛋白质组计戈iJ(HLPP)，包括对肝脏蛋白质中，34％为质膜或质膜相关蛋白质．组的研究【1'2】．为了能最大限度地利用人肝组织，中1材料和方法国科学家决定先用C57小鼠肝脏进行蛋白质组方法学研究．1．1材料在绝大多数真核细胞中，约有1万多种蛋白质，电泳试剂购自GE生物公(Uppsala，Sweden)和它们有105～106的浓度差．因此当用全细胞为材料时Bio—Rad公司(Hercules，Califomia，USA)．NADHubi．通常很难得到

4、中、低丰度的蛋白质．为此，很多研究97quinoloxydoreductase39单抗，catalase单抗，Golgi者转向亚细胞的蛋白质组研究【3，4】．细胞质膜是细胞单抗和辣根过氧化物酶偶连的二抗购自BD公司：小与外界接触的界面，参与各种细胞调节活动，是现有窝蛋白的单克隆抗体(Anti—caveolinmonoclonalanti—三分之二药物靶标所在位置．因此，质膜蛋白质组研body)和Na+／K+_ATPase的抗体(Anti—SodiumPotas—究是亚细胞蛋白质组研究的焦点【5~8】．siumATPase)购自abCam公司(Cambridge，UK)，我们对C

5、57鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的研LumiGLO发光底物购自KPL公司(GaithersburgMD，收稿日期：2007—06—01；接受日期：2007．07．25中国人类肝脏蛋白质组计划(CNHLPP，批准号：2004BA711A18)，湖南省教育厅及湖南省科技厅研究课题(批准号：05FJ2002，05FJ4018)资助十同等贡献4联系人，E—mail：liangsp@hunnu．edu．cn602中国科学C辑生命科学第37卷USA)；乙腈(色谱纯)以及其他的化学试剂(分析纯)购样品蛋白质的比例为1：100(质量比))切割过夜，随后自上海国药集团；水为Millipore纯水；

6、雄性C57BL／6J用胰蛋白酶(1：50(质量LL))37。C切割过夜．酶解后的小鼠(9周)购自湖南医科大学(长沙)．多肽混合物冻干以便进行质谱分析．胶内酶解根据我们实验室以前发表的文章【11]上1．2鼠肝细胞质膜纯化描述的方法进行．胶片用12．5ng／gL胰酶在25质膜纯化方法是根据Fleischer等人【91发表的文mmollLNH4HC03(pH8．3)中37℃酶解过夜，酶解液章，稍作修改．通过蔗糖密度梯度离心，依次收集位冻干至5uL进行质谱鉴定．于0．25mol／L／1．6mol／L(F1．60)、0．25mol／L／1．45mol／L(F1．45)以及0．25mol／

7、L／1．35mol／L蔗糖界面的1．7MALDI．TOF，ToF分析膜组分F1．35，最后收集的位于0．25mol／L／1．35mol／L从2DE或IDE胶上切下的点经酶解后点到蔗糖界面的膜组分定义为质膜．AnchorChipTM板上，以便质谱分析‘12】．质谱分析使用德国Bruker公司UltraFlexMALDI—TOF—TOF飞行1．3．电子显微镜分析时间质谱仪进行．氮气激光(337nm)反射模式进行F1．60，F1．45和F1．35组分均用2．5％戊二醛固定肽指纹图谱分析(PMF)，