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RESPONSETOTHERMALSTRESSINWESTERNFLOWERTHRIPS，FRONKLINIELLAOCCIDETALISbyLIHoNG．BOADISSERTATIONSUBMITTEDINPARTIALFULFILLMENTOFTHEREQUIREMENTSFORTHEDEGREEOFDOCTORINAGIUCULTURALINSECTS&PESTCONTROLADVISOR：(PROFESSOR)DUYU—ZHOUYangzhouUNIVERSITYYangzhou，Jiangsu，CHINAJune，2013 本研究得到农业部公益性行业专项(编号：200803025，201103026)和江苏省高校研究生创新基金(编号：CXZZl2_0910)1拘资助。ThisresearchwasfundedbytheSpecialFundforAgro—ScientificResearchinthePublicInterestⅢO．200803025，20103026)andbyScientificInnovationResearchofCollegeGraduateinJiangsuProvince，China(NO．CXZZl2—0910)． 入侵害虫西花蓟马的对温度胁迫的响应中文摘要西花蓟马是危害园艺作物的世界性害虫。该害虫于2003年首次在北京发现，近年来已迅速蔓延至我国大部分地区，危害日趋严重。西花蓟马在入侵过程中，在夏季常常遭遇夏季的高温和冬季的低温胁迫，但有关该害虫的温度耐受性及其调控机制还未见报道。本文采用生态学和分子生物学的方法，研究了温度胁迫对西花蓟马的存活能力、繁殖的影响及温度胁迫后西花蓟马热蛋白的表达变化等内容。其主要结果如下：研究了不同低温和不同暴露时间对西花蓟马存活率和繁殖的影响。结果表明，西花蓟马的存活率在暴露温度的降低和暴露时间的延长而逐渐降低。在1-6h范围内，杀死50％西花蓟马若虫所需的温度(Ltem50)分别为．13．6、．12．5、．11．2、-10．4oC，这些值要高于响应时间下杀死雌成虫的Ltem50，但低于杀死雄成虫的Ltem50。因此，西花蓟马不同发育时期的耐寒性强弱顺序可表示为：雌成虫>若虫>雄成虫。成虫和若虫暴露于．13℃和．13．5℃下2h后，其存活率分别为25％和27％。根据识别温度定义，这两个温度分别被定义为若虫和成虫的识别温度。将成、若虫在0或5"C到Jl化2h后，再置于各自识别温度下，其存活率都得到了明显提高。其中，在O'C下驯化2h后，若虫和雌雄成虫的存活率得到了最大幅度的地提高，分别达46％、54％、49％。西花蓟马若虫经不同低温处理后，其发育历期、羽化后的成虫寿命、产卵时间与对照相比无显著差异，但产卵量显著降低；成虫经过低温处理后，其寿命，产卵量和产卵时间明显降低。调查了不同高温(33、35、37、39、41oC)，暴露时间(O．5、1、2、4h)以及发育时期对西花蓟马存活及繁殖的影响。结果表明，西花蓟马成虫(雌虫和雄虫)和若虫的存活率在高温下随暴露时间的延长而显著降低，杀死成虫和若虫50％个体的温度在在O．5到4h范围内随时间的延长而逐渐降低。因此，西花蓟马不同发育时期的耐热性强弱顺序可表示为：雌成虫>若虫>雄成虫。奇怪的是，成虫在31oC，若虫在33oC下预热处理2h后，显著提高了其在致死高温下的存活率。经过2h的高温暴露后，西花蓟马成虫的寿命和产卵量随温度的升高显著降低。高温下的交配实验表明所有交配处理(U毋+S早S8+u早，S8+S早)的寿命和产卵量显著低于对照组(U8+u早)。uS+s早交配组合下的寿命与sS+u早组合无显著差异，但显著高于sS+s早组合；u4+s早组合下的产卵量显著高于S8+U早组合，但与sg+s2组合的产卵量相当。 H采用RT-PCR和RACE的方法从西花蓟马中克隆了5个热激蛋白基因，并分别命名为Fohsp90，Fohsc701，Fohsc702，Fohsp60和Fohop。Fohsp90，Fohsc701，Fohsc702，Fohsp60和Fohop的cDNA全长分别为2508，2195，3065，2489，2276bp，其开放阅读框分别为2169，1920，1983，1728和1659bp。5个开放阅读框分别编码722，639，660，575和552个氨基酸，推测的分子量大小分别为83．26，69．8l，72．73，60．87和62．25KDa。序列分析发现5个热激蛋白与其他物种具有很高的相似性，并含有各自家族的保守基序。基因组和cDNA序列的比较分析发现，5个hsps分别含有3，4，7，5和10个内含子。此外，5个hsps内含子的数量和插入位置与其他物种相比存在高度差异。最后，5个Hsps的系统发育分析表明本研究所获得的5个Hsps为各自家族的同源物。采用Real．timePCR检测了5个西花蓟马热激蛋白基[司(hsp90，hsc701，hsc702，脚60，hop)在不同发育时期和不同温度胁迫下的表达模式。不同发育阶段的表达模式表明，5个hsps在若虫，蛹和成虫时期具有表达，其中hsp90，hsc701和hsp60随着发育的进行呈显著的上调表达，而hsc702和hop的表达水平在三个时期无显著差异。在成虫和若虫期，5个hsps对低温不十分敏感，但都能被高温诱导上调表达，而且经高温诱导后若虫期5个hsps的表达水平显著高于成虫。西花蓟马成虫和若虫经高温驯化后，其表达水平显著高于直接暴露致死温度下的表达水平。’研究了温度的升高和亚致死剂量阿维菌素对西花蓟马的生物学参数、抗氧化酶和热激蛋白表达的影响。结果表明：温度和阿维菌素浓度对西花蓟马的生物学参数具有显著影响。存活率、寿命和产卵量随温度和阿维菌素浓度的升高而明显降低。温度和阿维菌素显著降低了SOD的活力，温度的升高对CAT的活力没有显著影响，但阿维菌素与之的相互作用显著提高了其活力。然而，温度和阿维菌素浓度及其交互作用显著提高了POD和GST的活力。hsps的表达模式表明，温度的升高仅能诱导hsp90、hsc702、hop的上调表达。然而，温度和阿维菌素的联合作用导致5个hsps的显著上调表达，其中hsp90、hsp701、hsc702齐nhop在330C最大值，hsp60在21oC达最大值。综上所述，西花蓟马较强的温度耐受性和快速驯化能力可能是西花蓟马能迅速入侵扩散的重要因素，其内在机制(特别是在高温胁迫下)可能与分子伴侣热激蛋白的上调表达有关。关键词：西花蓟马，低温，高温，存活率，适合度代价，热激蛋白，表达模式，Real-timePCR． Responsetothermalstressinthewesternflowerthrips，AbstractⅡIThewesternflowerthrips，Frankliniellaoccidentalisisaworldwideinsectpestofhorticulturalcrops．F．occidentalishasdispersedtomanyareasinChinaandthedamageisbecomingmoreandmoreserioussinceitWasfirstreportedinBeijingin2003．DuringspreadofEoccidentalis，theyoftenencounterheatstressinsummerandcoldstressinwinter．Unfortunately,thermaltoleranceandcorrespondingregulatingmechanisminthispesthaveneverbeenstudied．Inpresentstudy,toleranceandreproductiontocoldandheatstressinF．occidentalisanditscorrespondingphysiologicalmechanismwerestudiedbyecologyandmolecularmethod．Themainresultsareasfollows：Thepresentstudyexaminedtheeffectsofdifferentlowtemperatures，exposuredurationonsurvivalrateandfitnessofEoccidentalis．Resultsindicatedthatsurvivalrateofbothadultsandlarvaesignificantlydeclinedwithdecreaseoftemperatureandextensionofexposureduration．Duringthedurationfrom1to6h，thetemperatureneededtokill50％individuals(Ltemso)forlarvaeWashigherthanthatforadultfemales，butlowerthanthatforadultmales．Therefore，theorderincoldhardnessofdifferentlifestagesWaspresentedas"adultfemale>larvae>adultmales．WhenlarvaeandadultsofF．occidentalisweretransferredfromthenormalrearingconditionsat264-1oC，tocoldtemperaturesat一13。C(forlarvae)or-13．5oC(foradults)for2h，survivorshiprateWasonly25％forlarvaeand27％fortheadults．Thesetwotemperaturescouldbedefinedasthediscriminatingtemperaturesforthetwoinsectstages，respectively．Survivalratesofthethripsthatwerepretreatedat0。Cor5。Cfor2hbeforeexposuretotheirdiscriminatingtemperaturesincreasedsignificantly,andmaximumincreaseinsurvivorshipstothecoldtemperatureswasachievedbypretreatinglarvaeoradultsat0。Cfor2h，whichresultedinasurvivorshiprateof46％，54％，49％forlarvae，adultfemalesandmales，respectively．Whencoldexposuresoccurredatthelarvalstage，therewerenodifferencesindevelopmenttime，longevityandreproductiondurationofenclosedadultsrelativetothenon-treatedcontr01．Howeverthenumberofeggslaidoftheadultsderivedfromcold-treatedlarvaewassignificantly IVlessthanthatofthenon-treatedthrips．Whenadultthripswereexposedtothecoldtemperatures，thelongevity,fecundityandreproductiondurationalldecreasedsignificantlycomparedtothenon．coldtreatedcontr01．Thisstudyinvestigatedtheeffectsofhightemperatures(33，35，37，39，41oC)，exposuredurations(0．5，1，2，4h)andlifestagesonsurvivalandreproductionofthewesternflowerthrips．Resultssuggestedthatthesurvivalrateofadults(femaleandmale)andlarvaedeclinedsignificantlywiththeincreaseintheexposuretimeatallhi曲temperatureexamined．Therefore，theorderinheatresistanceofdifferentlifestagesWaspresentedas：adultfemale>larvae>adultmalesThelethaltemperatureneededtokillthe50％oftheadultsandlarvaedecreasedrapidlywiththeincreaseintheexposuretimefrom0．5to4h．Surprisingly,preheattreatmentat31(adults)or33oCfor2h(1arvae)significantlyimprovedthesurvivalrateofbothstagesafterexposuretolethalhightemperature．After2hexposure，longevityandreproductionofadultslowed’remarkablywiththeincreasingtemperature．Matingexperimentafterexposuretohightemperaturedemonstratedlongevityandreproductioninalltreatments(U8+S早，s3+u早，s毋+s早)werelowerthanthoseincontrolⅣ8+u早)．Longevityinu艿+S早treatmentwasnotdifferentfrom．thatinS毋+U早treatment，butwashigherthanthatins3+s早treatment；whilethereproductioninu3+s早wassignificantlylowerthanthatins3+u?，andrelativetosS+s?，suggestingthathi曲temperaturehaveadverseinfluenceonadultfemaleandmale，buttheeffectsonfemalewasmoreseriousthanmale．FiveheatshockproteingeneswereclonedfromEoccidentalisbyRT-PCRandRACE，andwerenamedFohsp90，Fohsc701，Fohsc702，Fohsp60andFohop，respectively．ThecompleteeDNAofFohsp90，Fohsc70，Fohsp60andFohopare2508，2195，3065，2489，2276bp，respectively,andtheirrespectiveopeningreadingframesare2169，1920，1983，1728，1659bp，whichencode722，639，660，575and552aminoacidswithpredictedmolecularweightsof83．26，69．81，72．73，60．87and62．25KDa，respectively．SequenceanalysissuggestedthatthefiveHspssharedhighsimilaritywiththoseofotherspeciesandcontainedconservedmotifsfoundintheirrespectivefamilyofotherspecies．AnalysisofgenomicDNAdemonstratedthatthefivehspscontained3，4，7，5，10introns，respectively．Inaddition，thenumberandpositionsofintronsoffivehspswerehighlydifferentfromthoseofotherspecies．Finally,phylogeneticanalysissuggestedthatthefiveHspswerehomologuesoftheirrespectivefamily． VExpressionpatternsoffiveheatshockproteingenes(hsp90，hsc701，hsc702，hsp60，hop)inresponsetodevelopmentanddifferenttemperatureswereexaminedbyReal-timePCR．Resultsshowedthatfivehspswereexpressedatlarvae，pupaeandadultsstage．Amongthem，hsp90，hsc70andhsp60weresignificantlyup-regulatedwi也theprocessofdevelopment．whiletheexpressionlevelofhsc702andhopwerenotdifferentamongthreestages．Thefivehspswerenotverysensitivetocold,butweresignificantlyinducedup-regulationbyheat，andtheexpressionleveloffivehspsinlarvaewerehigherthanthatinadult．Inaddition，pre-heattreatmentleadtosignificantup-regulationoffourgenescomparedtodirectexposuretolethalhiglltemperature(contr01)．Thecombinedeffectsofelevatedtemperatureandsub—lethaldoseofavermectinsonbiologicalparameters，antioxidantenzymesandheatshockproteinmRNAlevelwerestudied．Resultsshowedthattemperatureandavermectinsconcentrationssignificantlyinfluencedthebiologicalparameters．Thesurvival，longevityandreproductiondecreasedwithincreasedtemperatureandpesticideconcentration．ElevatedtemperatureandavermectinssignificantlydecreasedactivityofSOD．ElevatedtemperaturehadnoeffectonactivityofCAT，butitsactivitywasobviouslyimprovedbythecombinationoftemperatureandavermectins．ActivitiesofPODandGSTsignificantlyincreasedafterexposuretocombinationoftemperatureandavermectins．ExpressionpatternsofHspsmRNAshowedthatonlythreeheatshockproteins(hsp90，hsc702andhop)wasinducedup-regulationbytheelevatedtemperature，andshiftedfoldsisverysmall．However，INehspslevelwassignificantlyup-regulatedafterexposuretoconditionsofthecombinationofelevatedtemperatureandavermectins，andthehighestlevelofhsp90，hsc701，hsc702andhopWasreachedat33。C，butthehighestlevelofhsp60wasobservedat21oC．Takentogether,relativestrongtolerancetoextremetemperatureandrapidhardeningresponseofthewesternflowerthripsmaybeimportantfactorsthatdetermineitsrapiddispersalinchina，andtheunderlyingmechanism，especiallyunderheatstressconditions，mayberelatedtoup-regulationofthemolecularchaperonHsps．Keywords：Frankliniellaoccidentalis，lowtemperature，hightemperature，survival，fitness，Hsps，expressionpatterns，Real-timePCR． 录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IAbstract．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．III第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11昆虫耐寒性和耐热性的评价方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1昆虫耐寒性的评价方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2昆虫耐热性的评价方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52温度胁迫对昆虫的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72．1温度胁迫对昆虫存活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．2温度胁迫对昆虫繁殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．3温度胁迫对昆虫生理生化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93昆虫对温度胁迫的适应性机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯113．1驯化和快速锻炼⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．113．2昆虫地理种群的分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．113．3抗氧化反应及小分子物质的积累⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一123．4候选基因的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．133．5热激蛋白的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．134昆虫对温度胁迫适应的研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175西花蓟马的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175．1西花蓟马的简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．175．2温度对西花蓟马的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．186本研究的立题依据及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯197研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20参考文献：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第二章低温胁迫对西花蓟马存活及生殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30日Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3Ul材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．1供试虫源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．311．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31 1．3数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．322结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．1西花蓟马成虫和若虫的耐寒性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．322．2西花蓟马识别温度的决定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．3快速冷驯化对西花蓟马存活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一332．4．西花蓟马耐寒性的持久性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．3快速冷驯化处理若虫后对其发育历期，寿命、繁殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．4快速冷驯化处理成虫后对其寿命，繁殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．343小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43第三章高温胁迫对西花蓟马存活及生殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46日Ⅱ吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．401材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯461．1供试虫源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．461．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．471．3数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．482结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯481．1高温西花蓟马存活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．482．2高温驯化对西花蓟马存活率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．492．3驯化时间对西花蓟马存活率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．492．4高温胁迫对西花蓟马寿命及产卵的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．502．5高温胁迫后西花蓟马的不同交配方式对寿命和生殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．503小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯563．1高温胁迫对西花蓟马存活率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．563．2快速热驯化对西花蓟马存活率的影响及其生态学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．573-3高温胁迫对西花蓟马生殖的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．58参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60第四章西花蓟马5个Hsps基因的克隆及其序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63日Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．631．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一64 1．2实验方法与步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．642结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．702．15个Hsps基因的的序列特征分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．702．2西花蓟马5个Hsps的基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯852．3西花蓟马5个Hsps序列比对和系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯883讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯923．1西花蓟马5个Hsps基因的序列特征分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯923．2西花蓟马5个Hsps序列比对和系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯953．3西花蓟马5个Hsps基因的结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．97第五章西花蓟马5个lisps基因的表达模式分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1010日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1011．1供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1011．2试虫处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1011．3用于实时定量的eDNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1021．4实时定量引物的设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1021．5西花蓟马5个Hsps基因实时定量分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1021．6数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1022结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1032．1实时定量PCR标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1032．25个Hsps基因在不同发育阶段的表达模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1032．35个Hsps基因在不同温度下的表达模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1042．4高温驯化对西花蓟马5个Hsps基因表达的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1053小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1123．15个Hsps基因在西花蓟马发育中的表达模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1123．2温度胁迫对5个Hsps基因表达模式的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1133．3高温驯化对5个Hsps基因表达模式的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．114参考文献t⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一115第六章温度升高和阿维菌素对西花蓟马的联合作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯118 前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．118日Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．石1．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1181．1化学试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1181．2供试昆虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1191．3实验处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1191．4生物学研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1191．54种抗氧化酶的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1191．65个Hsps基因mRNA表达模式的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1211．7数据统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1212结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1212．1温度和阿维菌素对西花蓟马生物学参数的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1212．2温度升高和阿维菌素对西花蓟马4种抗氧化酶活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1222．3温度升高和阿维菌素对西花蓟马Hsps基因mRNA表达的影响⋯⋯⋯⋯⋯1223小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一127参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯129第七章全文总结与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1351主要结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1322本论文的创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1343研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．134攻读学位期间发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯137致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯136扬州大学博士学位论文原创性声明和使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯137 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应第一章文献综述昆虫是变温动物，其生命活动受到许多生物和非生物因子的影响，包括温度(高温和低温)、干燥、光照、辐射、重金属、食物、寄生、捕食等。其中温度是最基础的环境因子之一。在时间和空间范围内，它直接和间接地决定了昆虫的生态学和进化的各个方面(Hoffmann，2003)。例如，温度影响着昆虫的免疫功能、交配、繁殖以及生长(刘丽辉，2008)。在自然界，温度也是造成昆虫死亡的重要因子，昆虫对温度的适应能力决定了昆虫分布和种群动态(景晓红，2002)。因此，对于昆虫而言，温度是最重要的生态因子之一。在自然界，环境温度是多变的，这对昆虫的繁衍构成了极大威胁。昆虫为了能适应环境，必须具备一定的耐受能力；否则，将面临灭亡。全球气候变化除包括极端高温外，还包括极端低温，而且二者出现的频率将增多。因而极端温度对昆虫种群的影响，昆虫应对极端温度的行为进化与适应成为生态学与进化生物学领域研究的核心。l昆虫耐寒性和耐热性的评价方法1．1昆虫耐寒性的评价方法1．1．1昆虫的过冷却点的测定过冷却现象是指体液温度下降到冰点以下而不结冰的现象，常常以过冷却点来反映。过冷却现象是Fahrenheit于1842年首次发现，但直到1899年俄罗斯生物学家乌莎廷斯卡娅才在昆虫中发现过冷却现象，并采用电热测温技术测定了昆虫的过冷却点，随后他对这一现象进行了科学的阐述(乌莎廷斯卡娅，1960)，并将其引入到昆虫抗寒性的评价当中。后来许多学者都采用过冷却点来评价昆虫抗寒性。过冷却点的测定原理是当昆虫遭遇低于过冷却点以下的低温时，体内的体液会开始结冰，虫体释放热量，通过测定释放的热量来计算昆虫的过冷却点(鞠瑞亭，2002)。在早期的研究中，常采用温差热电偶的方法来测定昆虫的过冷却点。具体操作方法是首先将打开制冷装置(如冰箱)，然后将虫体用凡士林粘在热电偶上，一起放入制冷装置中。此时，虫体的体温变化可以由记录仪上记录的温差电动势变化曲线来反映。但该装置的缺点是测定昆虫种类少，热电偶的灵敏度较差和装置体积比较大等。鉴于上述缺点，秦玉川对装置进行了改进(2000)，采用热敏电阻+数字万用电表来测定供冷却点。该方法测定的原理是昆虫的过冷却点与电阻符合指数函数模型，公E上。上式为：绗2胝⋯6，其中RT为热敏电阻在绝对温度下得电阻值；R0为热敏电阻在绝对温度 2扬州大学博士学位论文TO时的电阻值；To、T为介质(环境)的起始温度和变化后的温度；B为热敏电阻的材料常数。最近吕龙石等在秦玉川的基础上对昆虫夹进行了改进，缩短了测定时间，提高了测定效率，可用于定期的、连续的昆虫过冷却点与体液冰点的批量测定(吕龙石等，2011)，其测定装置见图1．1。综上所述，尽管多为学者对测定的测定方法进行了改进，但仍然存在一些缺点。例如，无法测定一些微小昆虫的过冷却点，如西花蓟马，烟粉虱等。因此，在测定过冷却点时尽量使用灵灵敏度高，且能自动记录的装置。其次，要尽量联合其它指标来评价昆虫耐寒性的强弱。图l-1测定昆虫过冷却点的简易装置(吕龙石等，2011)．Fig．1-1Asimpledevicefortestinginsectsuper-coolingpoint(Lveta1．，2011)1．1．2半致死温度(Ltemso)或半致死温度(Ltime50)由于许多昆虫属于避冻型，常常在高于过冷却点的温度死亡，过冷却点不能衡量耐寒性的指标，至少不能完全代表昆虫的耐寒性。因此，昆虫的耐寒性主要取决于在低温下的存活率。在昆虫毒理学中常采用LC50来表示杀虫剂或化学物质对昆虫的毒力。同样，目前主要采用半致死温度(Ltem50)或半致死温度(Lfime50)来评价昆虫耐寒性。Ltem50主要指在特定时间下，导致昆虫50％个体死亡所对应的温度；而Ltime50是指在特定低温条件下，导致昆虫50％个体死亡所对应的时间。一般的方法是，将供测试的昆虫置于5．7个低温下，所设置的温度范围和温度间隔因昆虫的种类而不同。所设置的温度不能太高也不能太低。温度过高昆虫全部存活，而温度过低又导致个体全部死亡，无法估算出致死中温。总的原则是最高温度下的死亡率0．10％左右，而最低温度下的死亡率为90．100％，保证中间温度的死亡率在50．60％左右。同样，将供试昆虫暴露在特定的低温下不同的时间，保证最短时间和最长时间所对应的的存活率在死亡率在10．90％之间就能计算／出Ltime50。通常情况下，要 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应想得到理想的Ltem50或Ltime50常需要进行预备实验。Ltime50或Ltime50可以利用逻辑斯蒂曲线进行拟合求得，其拟合的曲线一般呈“S”型。公式如下：Y=k／(1+e叶h)。其中，y为存活率，x为温度，k、a、b为相关估计系数。一a／b为半致死温(Ltemp50)(徐康等，2005)。在早期，就有研究者利用该模型对飞蝗(JingandKang，2004)和斑潜蝇(ChenandKang，2002)的Ltim50就行了估算。最近对红火蚁(许益镌等，2009)、方翅网蝽(Jueta1．，2010)、苹浅褐卷蛾(Bu．‘rgiandMills，2010)的研究中也取得了不错的拟合效果。图1．2苹浅褐卷蛾4(灰色圆点)、5(黑色圆点)、6龄(白色圆点)幼虫4个低温下暴露不同时间后的存活率(Bu-’rgiandMills，2010)．Fig．1—2Mortalityof4th(greydots)，5th(blackdots)and6th(whitedots)imtarEpiphyaspostvittanaatfourlowtemperaturesinrelationtoexposureinterval(Bu．‘rgiandMills，2010)．1．1．3伤害低温总和(sumofinjurioustemperature，SID在低温条件下，暴露时间也是影响昆虫存活率不可忽略的因素。在评价昆虫的耐寒性中，暴露温度常常是作为强度因子，而暴露时间则是数量因子。昆虫耐寒性同时受到暴露温度和暴露时间的交互影响。为了将2个因子同时用于评价昆虫的耐寒性，Nedve提出了“伤害低温总和(Sumofinjurioustemperature，SIrr)”的概念。它是指导致有效冷伤害的时间和有效低温的共同表达，即所获低温胁迫的累积剂量。利用三维结构图能很好的反应存活率，暴露低温和暴露时间三者之间的关系(图1-3A)。 4扬州大学博士学位论文A管：=害享BⅦ日薯2彳皇{图1．3伪苹果蠹蛾在不同温度和时间下的存活率(A：低温；B：高温)(StotterandTerblanche，2009)．Fig．1-3MeansurvivalofTleucotretaatdifferenttesttemperaturesfordifferentexperimentaldurations(A，lowtemperature；B，hightemperature)(StotterandTerblanche，2009)．这三者之间的关系采用数学模型可表示为：s(f'7)一矗茜利用该模型能计算昆虫在恒定低温下的存活率，但昆虫在自然界所经历的环境温度是多变的，因此该模型的首要缺点是不能用于估算昆虫在变温下的存活率；另一个缺点则是未考虑影响昆虫抗寒性的其它因素。因此，需要建立一个更加全面的模型来评价昆虫的耐寒性(景晓红，2004)。最近，钟景辉(2008)对上述的公式进行了改进，其方程式如下：S(t，T)=exp(a+bXtiTi)／(1+exp(a+bZtiTi)。式中S为死亡率，ti为特定低温暴露时间，其单位可根据实验具体情况选择日、小时或分钟等时间单元，Ti为特定低温暴露温度，单位为oC，i为变化温度处理数，i=1，2，3，⋯，ZtiTi为变化低温处理的低温累积；a、b为常数，其中．a／b的生物学意义为造成昆虫50％个体死亡时的低温累积，即“半致死低温累积”(Semi．1ethalsumofchillinjurioustemperature，LSCIT50)，以此指标比较耐寒性的强弱。式中EtiTi可以通过各温度及其暴露的时间计算，S可通过试验测定。与此前的模型相比，该模型克服了前人方程不能用于评价变化低温下昆虫耐寒性的缺点。1．1．4冷伤害昏迷恢复时间(Chillcomarecoverytime)冷伤害昏迷恢复时间已经被广泛接受作为衡量昆虫耐寒性的指标(Giberteta1．，2001；Hoffmanneta1．，2003；MaraisandChown，2008)。其定义是经低温处理的昆虫从在较高的温度环境中从冷伤害昏迷中苏醒到正常活动状态所需的时间。以果蝇为例，操作方法如下： 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应5收集果蝇成虫于玻璃瓶中，然后置于．5oC的水浴中。30-45min后，将含有成虫和若虫的玻璃瓶从水浴中取出，将成虫和若虫倒入培养皿中，迅速放入20oC的恒温培养箱中让其恢复。通过培养箱的玻璃门记录果蝇从水域中取出到开始能正常爬行的时间，即为冷伤害昏迷恢复时间(MaraisandChown，2008)。该方法的优点是操作比较简单，但缺点是可能比较费时，特别是记录恢复时间需要一直观察昆虫的活动情况，期间不能随意离开。1．2昆虫耐热性的评价方法1．2．1Ltemso和Ltimeso测定方法同抗寒性。1．2．2半致死高温累积(Semi-lethalsumofheatinjurioustemperature，LSHⅡ．So)LSHIT50的评价方法同LSCIT50。由于该模型没有考虑到对昆虫造成热伤害的高温累积下限(Lowerlimitedslimofheatinjurioustemperature，LLSHIT)，因此只适用于不同研究对象耐热性的比较或在已知试验设置的高温累积必然造成热伤害的条件下昆虫耐热性的评价。同样，昆虫的耐热性受到暴露温度和暴露时间的交互作用的影响。存活率、暴露高温和暴露时间三者之间的关系可以利用三维结构图来表示(图1-3B)。1．2．3临界最高温度(Criticaltemperaturemaximum，CTmax)临界最高温度(CTr瞰)被用于定义脊椎和无脊椎动物的耐热性己有60年的历史(CowlesandBogert，1944；LutterschmidtandHutchison，1997)。临界最高温度的早期定义是指运动器官受到损伤，昆虫丧失逃避能力时的那一温度(CowlesandBogert，1944)。LutterschmidtandHutchison认为CTm戤是一个很好的指标，是用于评价生物高温生理和散热能力的标准(LutterschmidtandHutchison，1997)。传统上，用于定义CTn瞰的生理状态是不断变化的，包括“失去翻正反应(10ssofrightingresponse)”，“肌肉痉挛的开始(onsetofmuscularspasms)”，“热瘫痪(heatparalysis)”，“热昏迷(heatcoma)”，甚至“热击倒(knockdown)”(BerriganandHoffmann，1998)。在果蝇耐热性研究中，研究人员将CTm缸定义为运动器官和体壁透气功能的正常运作上限温度(Lutterschmidt‰dHutchison，1997)。传统的研究表明，CT。懈主要是通过测量上述涉及的生理状态发生时昆虫体壁的温度来估算。随着研究的发展，研究者常采用了更加客观的方法，即用呼吸运动热量极限法和检测活动能力法相结合的方式来估计CTmax(LightonandTurner，2004；Folketa1．，2007)。呼吸 扬州大学博士学位论文运动热量极限法适用于测量具有非随意肌物种的CTm娃，以体壁通气功能的丧失来表示；而活动能力监测法则适宜具有随意肌物种CTm积的检测，以运动能力的丧失来表示。该方法的优点是既适于对非随意肌也适于对随意肌物种CTm腻的测定。体壁通气功能的丧失主要通过二氧化碳输出模式的改变来判断。总体而言，该方法的优点是能真实的反映昆虫的耐热性，缺点是仪器设备的价格十分昂贵。1．2．4击倒温度(Knockdowntemperature)和击倒时间(Knockdowntime)热击倒温度是指生物在加热过程中倒下那一刻所对应的温度，而热击倒时间是指生物从暴露在高温下到击倒所需的时间。一般的操作方法是将昆虫装在透明的容器内，置于加热容器中，从室温开始以一定的速率(如0．01oC／min)开始加热。在加热的初始阶段，昆虫会异常的兴奋。随着温度的继续升高，昆虫的活动能力逐渐减弱。到昆虫瞬时倒下那一刻的温度就称之为击倒温度。而击倒时间的测定方法是，从室温开始以一定速率开始加热，当到达某一温度后，在此温度下持续保持一段时间，直到倒下那一刻，记录所经历的时间，即为热击倒时间。目前，许多学者都运用该指标来评价果蝇的耐热性(Hoffmanneta1．，2010；MitchellandHoffmann，2010；Overgaardeta1．，2011)。‘A40已30芑是∞&霉"lOoB40p30善20量，ooC40230e重∞歪10oO24810’214Ta'r怕(h)图1-4昆虫耐寒性评价过程中所使用的方法(Terblanchecta1．，2011)Fig．1-4Methodsusedinevaluatingthecoldhardinessofinsects(Terblanchecta1．，2011) 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应从上述的研究可知，昆虫的耐寒性和耐热性可以用多种指标来评价。总体而言，这些评价方式可以分为两类，一类是将昆虫突然暴露胁迫温度下(急剧式)，另一类是通过缓慢的升温或者降温暴露到胁迫温度下(斜坡式)(图1-4)。这种斜坡式的变温认为更接近昆虫在自然条件下所经历的温度变化，而急剧的温度变化是昆虫在自然界不常遇到的。当然，斜坡式的评价方式也存在对昆虫的耐受性估计不足的问题。例如，昆虫在缓慢的温度变化过程中会遭遇饥饿和干燥，从而影响最终结果的准确性；同时，由于这混乱效应影响了昆虫温度耐受性的变化和遗传特性。然而，我们认为这种斜坡式的评价方式更容易反应生态学事实(Terblancheeta1．，2011)，尽管其它胁迫因子的混淆效应会影响昆虫在自然界的温度耐受性极限。此外，在斜坡式的评价方法中，昆虫所遭遇的干燥和饥饿胁迫所带来的影响时微小的，除非评价过程中涉及的是小动物和持续的时间较长。因此，在进行比较研究和理解潜在的混淆效应时，方法的选择十分重要。基于斜坡式的温度耐受性评价仍然是理解和预测昆虫对气候变化响应的重要方法。2温度胁迫对昆虫的影响2．1温度胁迫对昆虫存活的影响极端温度对昆虫最直接的不利就是影响其存活。就低温而言，昆虫的存活率随低温的降低而降低。此外，暴露时间对昆虫存活率的影响也不容忽视。Luciliasericata暴露在3oC和6oC下，其存活率随暴露时间的延长呈直线下降，且30C下的存活率显著低于6oC(PittsandWall．2006)。将美洲斑潜蝇Liriomyzasativae蛹分别暴露在0、2．5、5、10oC下1．16d的结果表明，在0至5oC的低温下暴露10d后，蛹全部死亡。美洲斑潜蝇各时期蛹的耐寒性存在差异，其中4日龄蛹的耐寒性最强，其半致死时间为4．53d(ZhaoandKang，2002)。对飞蝗Locustamigratoria的研究表明，虽然不同季节种群在低温下的存活率存在明显差异，但总的趋势是随着暴露时间的延长，杀死50％个体所需的温度(Ltem50)g渐身高。例如秋季种群的卵暴露在低温下6h后，Ltcm50为．28．6oC；当暴露时间延长至10d后，Ltem50则升高至．11．6oC，比前者提高了17oC(JingandKang，2004)。高温对昆虫的存活也极为不利，其存活率随温度升高和暴露时间的延长而降低。地中海果蝇刚羽化的成虫28．39oC的范围内暴露1h后的存活率全部大于90％，在41oC下的存活率也高达70％。然而随着温度的持续升高，存活率呈线性关系下降，至45oC时存活率变为0(Kalosakaeta1．，2009)。对两种烟粉虱的研究表明，37oC以下的短时高温暴露对温室白粉虱雌雄虫的存活率没有显著影响，在39oC下的存活率则显著降低，尤以雄虫的下降趋势 8扬州大学博士学位论文更为明显；当温度升至45oC时，雌虫的存活率不足20％，而雄虫的存活率则为0(Cuieta1．，2008)；B型烟粉虱在高温下的存活率趋势与温室白粉虱相似，雌成虫在大于39oC的高温下的存活率显著高于雄虫，在45。C下雌性两性均有少部分个体存活(Cuieta1．，2008)。高温处理被认为是杀灭检疫害虫或仓储害虫的有效方式。对仓储害虫赤拟谷盗的研究表明，在42oC下杀灭成虫所需的Ltime50高达2645min，而杀灭幼虫的Ltime50也长达667．9min。在处理温度大于50oC后，幼虫的耐热性高于成虫。在50oC下成虫的Ltime50为39．9oC，而幼虫的Ltime50则为181．3min。至60oC，成虫和幼虫的Ltime50分别仅为9．1和19．1rain(Mahroofeta1．，2005)。2．2温度胁迫对昆虫繁殖的影响昆虫繁殖要所需的温度范围比生长发育更窄，任何温度的变化对其繁殖可能造成影响。例如，广聚萤叶寿命的寿命和产卵量随暴露温度的降低而降低。雌成虫在28oC下的寿命为88d，在14oC下暴露2h后，寿命为79．7d；在2oC暴露2h后只有69d。产卵量的趋势也是如此，在28oC下高达2l15粒，在2oC暴露2h后仅有891粒，比前者减少了1124粒(罗敏等，2011)。小菜蛾的蛹在4和6oC下处理后，在16oC下羽化成虫的产卵量随处理时间的延长而减少，处理时间为45d时，产卵量为0粒(陈非洲，2004)。低温储藏被认为是饲养天敌昆虫最有效的方法，因而必须考虑低温对天敌的生殖力的影响。对一种寄生蜂Gonatocerusashmeadi的研究表明，随低温储藏时间的延长，母代寄生蜂的产卵时间显著缩短，当储藏时间延长至60d时，产卵量减少90％。进一步的研究发现，这种低温影响具有遗传效应，当母带寄生蜂的储藏时间大于等于20d时，F1代寄生蜂的产卵量也显著降低(Cheneta1．，2008)。对另外两种寄生蜂Trissolcusbasalis和Telenomuspodisi的研究也得到了相似的结果(Foerstereta1．，2004)。此外，在低温条件下一些昆虫不能繁殖，继而通过滞育或休眠的方式进行越冬。例如，二化螟以滞育的老熟幼虫在田间越冬，而大螟以休眠的老熟幼虫进行越冬。高温对昆虫生殖也有不利的影响。禾谷益管蚜经过高于29oC的高温处理后，产卵量和寿命明显降低，且高温对成虫期的伤害要大幼虫期(Maeta1．，2004)。温室白粉虱经过37．43oC的高温处理2h后，产卵量从62．4粒下降到1．5粒，在45oC下处理2h后则不能产卵(Cuieta1．，2008)；在同样的高温条件下，B型烟粉虱的产卵量在各高温处理间没有明显差异，然而所产卵的孵化率随温度的升高显著降低(Cuieta1．，2008)。莲草直胸跳甲在25oC的恒温条件下，其产卵前其为4．1d；随着暴露温度的升高，产卵前期显著延长，在45oC暴露仅lh 奎塑婆：全堡量皇塑垄墅兰翌垫壁暨望堕堕壁!后长达7．3d；产卵量则从恒温下的965．1粒，下降至45oC下的260粒(赵鑫等，2009)。棉铃虫在40oC、42．5oC和45oC下分别处理360min、120rain和15rain后，雌虫不产卵，经过相同条件处理后，雌雄成虫则不能正常交配(Mironidis，20LO)。综上所述，温度胁迫对昆虫的生殖极为不利。温度胁迫导致的生殖能力的降低，主要原因可能是由于极端温度破坏了昆虫雌雄两性的生殖系统功能和交配行为(Arbogast，1981；Saxenaeta1．，1992；Mahroofeta1．，2005)。例如，高温能够影响雌虫卵巢和卵子的发育，从而导致产卵量的降低。此外，高温也能对雄虫的输经管及精子造成伤害，从而导致其不育(KrebsandLoeschcke，1994；王荫长等，1996；Scotteta1．，1997；Rineharteta1．，2000；郭慧芳等，2002)。2．3温度胁迫对昆虫生理生化的影响在组织和细胞水平上，有关低温对昆虫影响的研究还很少。总的观点是，在细胞平上，低温对昆虫的伤害主要是由于细胞功能的丧失和不溶蛋白聚集物的形成造成的(Coulsoneta1．，1992)。最近，活体燃料和直接显微观察被用于检测低温对昆虫的最常见的伤害。对Panstrongylusmegistus的研究表明，0或5。C的低温下导致了马氏管上皮细胞的凋亡减少但同时，与常温下的马氏管上皮细胞相比，低温处理导致了大量细胞的坏死。由此得出的结论是，低温可能通过直接抑制细胞凋亡或间接减少ATP能量而对昆虫造成伤害(Garciaeta1．，2002)。对耐结冰昆．d玫Eurostasolidaginis的染色观察表明，经过低温处理后细胞中的脂类物质体积增大，但没有细胞膜损伤的迹象(DavisandLee，2001)。进一步利用银光染色后发现，外皮肌，血细胞、导管及马氏管和脂肪体的前端对低温的敏感性增加。其中对低温伤害最敏感的是内脏器官、马氏管前端部分和唾液腺(YiandLee，2003)。对Eurostasolidaginis幼虫冰冻的脑组织的显微结构观察表明，脑组织中核膜的扩张和染色质的聚集于粗面内质网的扩张和细胞质中自噬体的增加有关。对肌肉组织的观察发现，低温可以引起肌丝破坏，导致肌肉组织z．字形肌纤维的丢失；同时，低温可以染色质排列紊乱，最终导致的细胞核的改变(Collinseta1．，1997)。这些证据表明低温容易引起昆虫肌肉和神经组织的损害，从而引起细胞膜的整体性，细胞骨架结构及提供能量的结构的破坏。低温引起的气管破坏和线粒体功能紊乱导致ATP的产生受阻(Denlinger，1991)，而核组织的改变似乎与昆虫遭遇低温引起的伤害有关(Collinseta1．，1997；Garciaeta1．，2002)。昆虫属于变温动物，保持和调节体内温度的能力不强。因此，昆虫的代谢速率十分依 扬州大学博士学位论文赖于环境温度的变化。任何昆虫都有其适宜自身生长发育的温度，一般在20．30。C范围内。一旦温度出现急剧变化，将引发其体内一系列代谢反应。如仓储害虫在检疫处理过程中所遭遇的温度变化会引起厌氧代谢。Cochliomyiamacellaria在经历急剧的高温后导致体内多元醇的增加和多元醇磷酸化(Meyer，1978)也是一个典型的例子。高温对昆虫代谢最重要的影响是酶的活性和酶促反应速率(杜尧等，2008)。高温可以影响底物与酶的结合，引起米氏常数Km值的改变，从而影响酶的代谢补偿(HochachkaandSommero，1984)。在特定的酶促反应中，温度的升高可以通过改变分子的比例而催化反应速率，而依赖于温度的天然自由能的活化被认为是自然温度补偿的分子基础。磷脂双分子层膜流动性的变化也会对膜结构和酶的活力造成影响(HochachkaandSommero，1984)。此外，高温也能影响昆虫体内的酶和代谢产物之间的关系和酶的结构，从而影响酶的动力学特性。这种影响在环境温度大于40oC后尤为明显。内分泌系统在昆虫抵御高温过程中的作用还不十分清楚。很明显，高温引起的神经功能失调最终会导致昆虫内分泌系统的活力的改变。而昆虫发育和生殖过程中的变化正是由于内分泌系统的改变引起的。例如，在高温条件下，果蝇可育的比例随暴露温度的升高而急剧下降，最终导致全部绝育(Rohmereta1．，2004；Davideta1．，2005)。另一个典型的例子来自苹果蠹蛾。研究发现，以每小时4oC的速率从常温升至38oC，在此温度下保持4d没有立即杀死苹果蠹蛾的5龄幼虫，但没有一个个体能发育至6龄(NevenandRehfield，1995)。在第一个例子中，高温可能对果蝇的内分泌系统造成了影响，进而阻止了生殖细胞的成熟，最终可能影响卵内卵黄蛋白的沉积。至于苹果蠹蛾发育的例子，可能是由于昆虫体内保幼激素水平过高而不能支持蛹的形成和发育的进行。在高温下，有关昆虫发育的异常、畸形和延迟的例子数不胜数(DenlingerandYocum，1998)，而这些影响可能是由昆虫分泌系统的异常所造成的。此外，高温对昆虫内分泌系统的影响还包括：(1)前脑的神经分泌细胞变小引起的促前胸腺激素水平的下降；(2)保幼激素滴度的改变；(3)对保幼激素的影响；(4)蜕皮激素、脂肪动用激素等的改变(Neven，2000)。生物大分子的空间构象决定其生物活性，空间构象的改变常会引起其功能的改变。在高温条件下，生物大分子维持形状的能力受到严重影响，从而导致空间构象发生改变(Jaenicke，1991；Somero，1995)。生物体内典型的大分子物质主要包括DNA、RNA和蛋白质等。DNA和RNA复杂的二级结构和三级结构是其在生命体内发挥作用的基础，结构的复杂化使它们易受温度的影响。例如，一种摇蚊的唾液腺细胞在高温下经过短暂的高温处理后，发现核仁内致密纤维组分(densefibrillarcomponent，DFC)有颗粒状结构出现且纤维间的缝 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应隙增大；进一步的观察发现DFC内的rDNA发生了构象的改变且产生了新物质(Morcilloeta1．，1997)。黑腹果蝇经短暂的高温处理后，发现其染色体内的DNA发生隐性突变(OhandKim，2003)。因此，高温下DNA和RNA等遗传物质的改变对昆虫性状的遗传会产生重要影响。蛋白质是由许多多肽通过肽键连接而成。高温对蛋白质的影响主要是破坏的肽键的稳定性，改变蛋白质的结构，从而导致蛋白质功能的异常化或丧失。总之，由高温胁迫造成的伤害能影响昆虫的发育、存活、肌肉的收缩、飞行能力、生殖能力和其他更高组织水平的生理活动(DenlingerandYocum,1998；Rohmercta1．．2004；Chakireta1．，2005；KrcbsandThompson，2005；Jorgensencta1．，2006)．3昆虫对温度胁迫的适应性机制3．1驯化和快速锻炼驯化是指生物在非致死胁迫范围内长时期(数天或数星期)暴露，并获得增强的耐受性。它会同时导致生物体发生可逆和不可逆的生理变化，而快速锻炼是相对于驯化而言的一种非致死胁迫的驯化(通常是十几分钟至数小时)。当昆虫遭遇温度胁迫也存在这两种现象。研究发现将一种黄斑天牛直接暴露在．22下，只有不到30％的个体存活。而在0oC下锻炼4h，再将其暴露在．22oC存活率达到了60％。同样在15．5oC驯化9d，耐寒性也得到了相应的提高(YoshinoriandYukio，2007)。这可能是由于昆虫在经过驯化和锻炼后，昆虫的过冷却能力得到提高，从而使昆虫免受过冷却点以上低温的伤害。针对快速冷驯化，Locschcke(2005)提出“快速热驯化”一词，主要是指昆虫经过在非致死温度下驯化一段时间后能迅速提高在对随后的致死高温的抵抗能力。这种现象在许多昆虫中已经有报道，包括iDrosophilamelanogaster(KrebsandLoeschckc，1994；Dahlgaardeta1．，1998)、Drosophilaananassae(SisodiaandSingh，2006)、Cydiapomonella(ChidawanyikaandTerblanche，2011)等，但诱导最大快速冷驯化能力所需的时间和温度因物种的不同而有所差异。目前，有关驯化和锻炼的生理机制是否相同还存在争议，有的学者认为它们代表了不同的生理过程，反应了不同的机理。3．2昆虫地理种群的分化昆虫在长期的进化过程中对周围环境的适应导致了不同种群的差异(BubliyandLoeschcke，2005)。因此，昆虫地里种群的分化是昆虫对不同温度长期适应的结果。昆虫在长期的温度选择下，遗传差异决定了许多特征的地理分化，这些特征包括生活史、耐受性、 扬州大学博士学位论文形态和行为。这些种群间的差异是进化适应性的结果(Sambucettietal，2006)。例如，对飞蝗的研究发现，不同地理种群的耐寒性具有明显差异，生活在热带的种群耐热性高于温度种群，而耐寒性低于温度种群；hsp90和7D的表达也随地理纬度的变化而变化(WangandKang，2005)。而对斑潜蝇不同种群的研究也得到了相似的结果(ChenandKang，2004)。以上都是从地理纬度的角度来研究昆虫不同种群的耐受性的，而对不同海拔的研究还较少(钟景辉，2008)。目前，有关昆虫不同地理种群耐受性差异的研究都是从生理反应方面开展的，认为昆虫对环境温度的适应性进化史通过直接的温度来实现的。物种的长期进化导致了基因的变异，这种变异与昆虫的一系列适应性特征的关系怎样的呢?目前从基因水平来研究的报道还很少。如有研究发现等位酶的变异与与昆虫的一系列适应特征(形态和生理特征)有密切的联系(Watt，1992；Gneararder,2003)。这些研究有助于对物种温度选择的遗传基础的理解。3．3抗氧化反应及小分子物质的积累在生理水平上，昆虫在受到环境温度胁迫后的第一反应是氧化应激。氧化应激是机体对氧化剂和抗氧化剂的失衡的应激反应。在过氧化状态下，能导致脂质过氧化、蛋白质过氧化，导致细胞死亡(Sies，1997)。在生物进化过程中，生物体形成了一系列抗氧化防御系统来抵制氧化胁迫，从而得以生存。在生物界，昆虫具有特定的生理特征，气管系统输送的氧气经扩散作用抵达组织，昆虫飞行中，组织处在强氧化状态下，植食性昆虫所摄取植物富含氧化还原化合物，增加了正常情况下机体的氧化胁迫。与此相适应，昆虫发展了高效的抗氧化系统(抗氧化酶和非酶的抗氧化物)来减少氧化胁迫(Felton，1995)。生物体主要的抗氧化酶包括：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷肤甘肽过氧化物酶(GPX)、谷光甘肽一硫．转移酶(GST)。为了应对冬季气温的降低带来的不利影响，昆虫体内开始合成一系列的抗寒性物质。目前已知的小分子抗寒性物质有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇(可能是阿拉伯糖醇或核酸醇)、海藻糖、葡萄糖、果糖以及某些昆虫体内的氨基酸和脂肪酸。Duman(1982)对黄粉甲(TenebriomolitorLinnaeus)等13种昆虫的研究表明，糖蛋白的增加与抗寒力的增强有着十分密切的关系，因而糖蛋白又称为温滞蛋白，温滞蛋白通过吸附到冰核和冰晶表面来阻止水的晶化，从而降低冰点和过冷却点，产生温滞效应。不同昆虫积累的物质种类和含量存在差异，但大多数昆虫都由几种抗寒物质构成一个物质系统来增强抗寒性。例如．黄 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应地老虎幼虫以氨基酸．小分子糖．糖蛋白物质系统来增强抗寒性(黄国洋等，1990)；桦小蠹虫则以甘油．葡萄糖．海藻糖．山梨醇等物质系统增强耐寒性(HoldenandStorey，1994)。韩瑞东等(2005)则认为，赤松毛虫主要依赖小分子碳水化合物．糖蛋白．多种氨基酸构成的系统来提高抗寒性。在高温胁迫下，昆虫可能通过合成小分子物质来低于高温的伤害。例如，有研究者发现，在高温胁迫下蚜虫和粉虱体内的山梨醇和甘露醇含量显著增加；进一步的取食行为研究发现，高温刺激了蚜虫和粉虱的取食量的明显增加。由此推测，蚜虫和粉虱可能将从食物中获取的糖分转变成了甘露醇或山梨醇(Hen&ixandSalvucci，1998)。同时也有研究发现，甘露醇和山梨醇在昆虫体内的含量随气温变化而有所差异。在温度较高的中午，2种物质的含量要显著高于早晨(HendrixandSalvucci，1998)。因此，甘露醇和山梨醇在昆虫抵御高温过程中可能具有重要作用(Salvucci，2000；Chowneta1．，2011)3．4候选基因的诱导表达许多基因已经被鉴定作为昆虫温度耐受性响应的候选基因。例如，Dca(Goto，2000)、frost(Goto，2001)、hsr-omega(Singh&Lakhotia，1984)和AFP(赵干，2005；杨长庚，2006；吕国栋，2006；ClarkandWorland，2008)作为抗寒性的候选基因。Methusalah(Lineta1．，1998)、Turandot(EkengrenandHultmark，2001)作为耐热性的候选基因。然而，多数研究证实Hsps可以作为抗寒性和耐热性二者的共有的候选基因(FederandHofmann，1999；Hoffmanneta1．，2003)。因此，Hsps成为所有生物中研究最透彻的蛋白基因。3．5热激蛋白的研究进展热休克反应是fljRitossa于1962年首次报道的，他在实验中发现果蝇幼虫在经过高温处理后，唾液腺染色体出现明显的膨大现象。后来，Tissierseta1．(1974)将果蝇在高温下处理后发现一系列新的蛋白，即热激蛋白。热。相似的反应在其它动物包括昆虫中也发现。尽管高温是热激蛋白的经典诱导因子，但目前的研究发现该蛋白也能被其它胁迫因子所诱导，包括低温、干燥、杀虫剂、重金属、饥饿、密度等。在胁迫条件下，热激蛋白常作为分子伴侣帮助错误折叠蛋白的正确折叠而维持细胞内的渗透平衡，从而阻止了蛋白的聚合，促进错误折叠蛋白或变性蛋白的选择性降解(Johnstoneta1．，1998．FederandHofmann，1999；Hoffmanneta1．．2003)。此外，Hsps通过与细胞凋亡过程中各种成分的互作而影响细胞的存活，而这些成分位于线粒体的上游或者下游。 143．5．1热激蛋白的分类热激蛋白是一个庞大的蛋白家族。根据它们的分子量大小、氨基酸序列的相似性及功能大致可分为五大类：Hspl10、Hsp90、Hsp70、Hsp60和sHsps(LindguistandCraig，1988；FederandHofmann，1999)。根据其亚细胞的位置可以分为：线粒体Hsps；内质网Hsps、内质网Hsps，在植物中还存在叶绿体Hsps；根据诱导表达特性，可以分为诱导性Hsps和组成型Hsps。3．5．1．1HspllO家族Hspl10家族的分子量范围为100．104KDa。该蛋白的主要功能是作为分子伴侣和调控子，依靠蛋白水解提供能量来调控受损蛋白的降解(BurtonandBaker,2005)。在热激条件下，通过非功能蛋白聚集而维持某些关键肽功能的完整性；同时也能帮助降解一些受损的不可逆蛋白。在植物中，研究得最为透彻的是来自于位于细胞质的ClpBl，该蛋白是植物高温驯化所必需的(Leeeta1．，2007)。然而，至今还未在果蝇及家蚕中发现Hspl10。3．5．1．2Hsp90家族Hsp90是真核生物中最丰富的细胞质蛋白家族，其分子量范围为82．90KDa。Hsp90的二级结构由Q．螺旋和p．折叠组成，其分子结构主要包括3个结构区域，即25KDa的N．端区域，12kDa的中间区域和35kDaC．端区域(图1-5A)。此外，在N．端和中间区域之间还存在一个不保守的连接区域(1inger)。N一端区域具有抗肿瘤抑制剂格尔德霉素(geldanamyein)和根赤霉素(radieie01)位点，能保证HSp90与两种霉素的有效结合；还具有ATP／ADP结合位点，能催化ATP的水解。中间区域的主要功能是与目的蛋白的结合，形成与N．端ATP互作的催化位点。C一端区域的主要功能是负责调控Hsp90的二聚化(PearlandProdromou，2006)。然而已有的研究表明，位于N．端和中间区域之间的连接区域在Hsp90中不起作用(PearlandProdromou，2006)。Hsp90的主要鉴别特征是其氨基酸序列的5个保守的签名序列，即NKEIFU冱LISNSSD舢LDⅪR、LGTIAKSGT、IGQFGVGFYSCYLVAD，IKLYVRRVFI和GWDSEDLPLNISRE(Gupta，1995)。此外，在C．末端还具有一个保守的序列，最为常见的为MEEVD。该多肽序列是Hsp90亚细胞定位于细胞质的典型标志。同时，该多肽能与具有TPR结构域的协同分子伴侣，如与Cyp40、Hop／Sti和Fkb的互作(PearlandProdromou，2006)。在生理条件下，有研究发现该蛋白能与几种细胞内蛋白互作，包括钙调蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、激酶和一些受体蛋Et(Carvereta1．1994；Teeta1．2007；Matsumiya 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应eta1．，2009)。在高等原核生物的内质网发现有Hsp90同源物的存在。当然，在原核生物中也存在Hsp90的同源类似物(Buchnereta1．1998)。在高温条件下，将Hsp90敲除后发现大肠杆菌的生长受到了一定的影响；而Hsp90在任何温度下都是酵母所必需的。在温度升高的条件下，细胞Hsp90浓度的降低导致哺乳动物细胞死亡率的增力t](Bansaleta1．1991)。在果蝇中，属于该家族的Hsp83位于染色体的63BC处，它能在果蝇的正常生长条件下成组成型表达。此外，已有研究证实hsp83是果蝇Hsp90家族中唯一一个含有内含子的热激蛋白基因(HackettandLis，1983)。3．5．1．3Hsp70家族Hsp70是最为保守的一个蛋白家族，其分子量范围为68—75KDa。Hsp70具有高度的保守性，如真核生物Hsp70之间的相似性为60．78％，真核与原核生物间的Hsp70相似性也有40—60％。在昆虫中，相近物种的Hp70相似性几乎都大于90％。正因为它的保守性，Hsp70及其同源物在从病毒到高等动物(如人类)的所有生物得到了大量研究。如同Hsp90--样，Hsp70的分子结构也含有三个区域(图1-5B)，即N．端约44KDa的保守ATPase结构域，其主要功能是与ATP结合；18KD的中间区域(middledomain)，主要是与已折叠或未折叠的蛋白结合；约25KDa的C一端区域，其中又可以分成保守的15kD的多肽结合功能域(polypeptide—bindingdomain)和不保守的靠近C一端最末端的10妨可变区和C一末端基序(图5B)(ZhangandDenlinger，2010)。不同类型的Hsp70成员的基序是特异性的，不同的多肽序列表明位于不同的亚细胞。例如C．末端基序为EEVD，说IjfJHsp70成员为与细胞质内；C一末端基序为KDEL，表明该Hsp70定位于内质网内；已有的研究表明，在同一物种类位于不同亚细胞的Hsp70的相似性比较低，而不同生物间相同细胞定位I拘Hsp70之间的相似性相对较高，说明不同亚细胞定位的Hsp70的起源可能不同，从而导致了功能的特异化。在各种胁迫条件下，Hsp70也是最为丰富的诱导蛋I兰1(Lachapelleeta1．2007)，其家族成员有的呈组成型表达，有的呈诱型导表达。例如，hsc70呈组成型表达，而^印70能被高温和其他胁迫因子诱导表达。人类的Hsp70家族至少含有11个成员，且Phsp70，hsc70，grp75，andgrp78。Hsp70的活力受协同因子伴侣的调控，如核苷酸交换因子(LeungandHightower，1997；MoroandMuga，2006)。Hsp70作为分子伴侣，在不利和正常环境中都具有主要作用。在细胞质中，Hsp70在前体蛋白组装形成多分子复合体前起稳定的作用；另外在将这些前体蛋白转移至线粒体和内质网过程中也具有重要的作用。在器官中，在蛋白折叠和组装前，Hsp70的主要作用则是维持新转运的蛋白呈以非折叠状态存在。Hsp70J麟促进不溶性多聚物和重新折叠的多肽的溶解(Marshalleta1．1990)。 扬州大学博士学位论文hakdr胛·dcKnh噜d口m岫～埘-“e"驴岫380387546634／635图1-5Hsp90并IHsp70的结构示意[蛩(zhangeta1．，2010)Fig．1—5SchematicstructuresofHsp90andHsp70(Zhangeta1．，20lo)．3．5．1．4Hsp60家族Hsp60家族的分子量范围为58．65KDa，其鉴别特征是在氨基酸序列的末端具“GGM”的重复基序。有该蛋白在多肽的折叠及蛋白的易位过程中发挥重要作用(VanderVieseta1．1993)。该蛋白的家族成员不仅在病毒细胞，而且在高等生物的线粒体和叶绿体中也有发现(Lundeta1．2003；Cappelloeta1．，2008)；同时，编码该家族蛋白的基因是形成了核基因组的一部分(Readingeta1．1989)。Hsp60禾lHspl0分别是大肠杆菌，GroEL和GroES的真核同源物，当它们存在于叶绿体时分别称为Cpn6031Cpnl0。Hsp60和HsplO的同源物在任何情况下都能组装形成一个大分子结构的盒子结构，该结构在其疏水性的内部拥有容纳位于变性蛋白的表面的疏水板块所需的空间。该组装过程与ATPase的活力有关，它能将ATP水解，提供能量用于控制变性蛋白特定疏水区域的释放，从而有利于天然三级结构的重新折叠。3．5．1．4sHsps家族sHsps家族的分子量范围为15．40KDa。该家族在古细菌，病毒，植物和动物中都有报道(TaylorandBenjamin2005；WatersandRioflorido2007)。该蛋白家族具有一个共同的保守特征，即在其C一端具有一个80-100个氨基酸的0【晶体结构域(LindguistandCraig，1988)。sHsps也具有组成型和诱导型两种表达模式。最近的研究表明，如同其它家族I拘Hsps--样，sHsps常作为分子伴侣阻止非目的蛋白的互作，协助变性蛋白的重新折叠。此外，该家族蛋白可能会经历可逆的磷酸化作用，并可能参与信号转导过程(deJongeta1．1993)。脊椎动物的sHsps可以分为(xA和c【B晶体两类，其分子量主要为25．27KDa(Hsp25／27)、20KDa(Hsp20)、17KDa(HspB3)。已有的研究表明，果蝇具有4个sHsps(Hsp28、Hsp26、Hsp23、Hsp22)(Southgateeta1．1983)；家蚕中具有6个Hsps(sHspl9．9、sHsp20．1、sHsp20．4、Hsp20．8、Hsp21．4、Hsp23．7)(Manjunathaeta1．，2010)；斑潜蝇中具有4个sHsps(Hspl9．5、 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应Hsp20、Hsp20．8、Hsp21．7)(Huangeta1．，2009)：而在二化螟中至少含有5个sHsps(陆明星未发表资料)。4昆虫对温度胁迫适应的研究展望随着微矩阵和2-D电泳技术的发展，昆虫生理学家逐渐开始探索昆虫对环境温度响应的生理机制。以果蝇为代表的全基因测序物种将成为研究昆虫对温度耐受性的理想材料。以后的研究可能会利用这些物种进行更多的遗传学研究，鉴定与昆虫耐热性相关的基因(Rakoeta1．，2007)。这将有利于对温度耐受性相关候选基因的筛选，同时有利于阐明调控其他昆虫对温度胁迫的响应机制。随着越来越多物种基因组测序的完成，导致大量的ESTs数据库和与昆虫免疫相关的基因组资源的增加。如此多的信息使得利用各种分子生物学技术鉴定相关的基因或蛋白变得十分容易，同时对非模式昆虫的研究也不再受到技术的限制。然而，这样的研究应该选择具有生态学意义的物种进行探索，这使得我们能够决定物种间的相关性程度，也有利于资源的共享。例如，微距阵数据和靶标基因和Q。PCR的引物等。这样研究是十分有必要的，尤其在一些基因组资源有限的物种中。需要指出的是，在以技术为导向的时代，基因组学并不能回答所有的问题。因此，需要多学科的研究人员共同合作，尤其是生态学家和能提供分子结果的生理学家的合作。当然，这并不是说新诞生的技术如代谢组学和蛋白组学不加以利用，只是鉴定与昆虫耐受性相关的蛋白和生化成分是表达分析的最后阶段所考虑的问题(MichaudandDenlinger，2007)。至于激发对低温反应的因素，并不在于基因本身，而是在于转录因子和信号分子(如p38-Mapk)(Fujiwaraeta1．，2006)。这一研究方向至今在非模式昆虫中还未探索过。但需要说明的是，对昆虫耐受性机制的研究固然十分重要，但更大的价值在于与基因组可塑性和进化相关的研究的结合。昆虫如何响应和适应全球气候的变化是预测未来生物多样性所面临的一个巨大挑战。入侵生物的全球扩散危害所造成的生物多样性降低就是一个十分贴切的例子。此外，以后的研究应多关注气候变化对极地昆虫的影响(SinclairandStevens，2006)。因此，采用多种研究方法研究昆虫如何应对全球气候变化将是未来的主流。5西花蓟马的研究进展5．1西花蓟马的简介西花蓟马属缨翅目，蓟马科，花蓟马属，又名苜蓿蓟马或西方花蓟马。由于其极强生 扬州大学博士学位论文殖潜力，迅速的入侵力，广泛的危害性和极强的抗药性，使得西花蓟马的防治十分困难，因而该虫被认为是全世界最重要的农业害虫之一。西花蓟马的成虫主要通过针状的下颌骨刺伤植物组织，吸收刺伤细胞内的营养成分而获取食物。成虫和若虫的取食使叶片、花朵和水果产生疤痕，从而导致作物的损失和影响植物的生长和生理。此外，由于西花蓟马将卵产植物的组织中，这明显降低了园艺作物的市场价值。最为重要的是，西花蓟马还是两种重要植物病毒番茄斑萎病和凤仙花坏死斑病毒的携带者(陆亮等，2009)。最近的研究表明，该害虫还是菊花干坏死病毒、花生环斑病毒、番茄褐绿斑点病毒的携带者(Pappueta1．，2009；Webstereta1．，2011)。需要指出的是西花蓟马的生殖、入侵、寄主危害、传播病毒的能力和抗药性之间是相互联系的。这些联系都与西花蓟马的生物学特性息息相关，。而生物学特性对温度具有强烈的依赖性。因此，研究温度对西花蓟马生物学和生态学的影响对深刻理解该害虫的入侵、寄主危害、传播病毒的能力和抗药性具有重要的意义。5．2温度对西花蓟马的影响西花蓟马的发育对温度和寄主具有强的依赖性，发育速率十分迅速，在一个作物生长期内，西花蓟马可以发生数代。已有的研究表明，西花蓟马没有发育或生殖滞育的特性(Ishidaeta1．，2003)。因此，在高于发育起点温度(4．100C)时，西花蓟马就能生长发育(Katayama，1997；McDonaldeta1．，1998：李景柱等，2007；刘丽辉等，2008)。不同的研究所得到的发育起点温度具有差异。以蛹期为例，张治军等(2012)的研究结果为7．8oC，李景柱等(2007)的为6．84oC，而刘丽辉等(2008)的则为6．5oC。西花蓟马的生长发育速率随温度的升高而逐渐加快，其最适宜的温度范围为25—30oC。在此范围内，从卵发育至成虫只需9．13d(Katayama，1997；Reitz，2008)。卵的发育历期相对较长，在适宜的温度下也需要2-4d孵化为为1龄若虫。l龄若虫的发育历期约为2龄若虫的一半，2龄若虫以后西花蓟马开始停止取食，并准备化蛹。西花蓟马常在土壤中化蛹，但也有相当一部分数量仍然停留在寄主植物上，特别是那些花卉结构较为复杂的植物(BuitenhuisandShipp，2008)。第一个蛹期被称为预蛹，接着为蛹期，从蛹到成虫羽化所需的时间随温度不同而有所差异，一般为1．3d。在实验室条件下，成虫的寿命较未成熟阶段的发育时间长。例如，在28oC下，从卵发育至成虫的时间为12d，而雌成虫的寿命为26d，个别雌成虫的寿命可长达5周(Reitz，2008)。温度对西花蓟马的产卵也具有显著影响，随温度的升高产卵量相助提高；当温度高于30oC后，其产卵量又显著降低。例如，张治军等(2012)的研究表明，在15oC、20oC和25oC 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应条件下，西花蓟马的产卵量分别为37．70，32．56，37．80头／雌，显著高于30oC条件下的平均繁殖力(9．36头／雌)。西花蓟马的种群增长参数净生殖率fro)、内禀增长率(rm)均在在25oC时达最高值，分别为20．10和0．178d～。此外，温度对西花蓟马的雌雄比例也具有影响。在20．25oC范围内的比例为1．1．2，而低于和高于此温度范围，雌虫比例显著降低(张治军等，2012)。由于西花蓟马较强的入侵性，评价西花蓟马对极端温度的耐受性对未来预测西花蓟马的分布和制定科学的管理策略是十分必要的。研究表明，西花蓟马的过冷却点(SCP)为．26oC，SCP不受饲养温度和光照的影响，说明该害虫具有较强的抗寒性(Tsumukieta1．，2007)。Mcdonald等(1997)的研究表明，西花蓟马1龄若虫在二5一．9oC范围内，暴露2h的存活率均大于90％，随温度的降低，其存活率显著下降。当温度下降至．11．5、QC时，存活率为30％；而在．15oC时也还有约10％的个体存活。由于西花蓟马在高于过冷却点的温度就死亡，因此该害虫属于不耐结冰型。此外，Mcdonald等(1997)还发现，西花蓟马经过非致死温度驯化一段时间后能迅速提高其在致死低温下的存活率，这一现象被称为快速冷驯化。西花蓟马的耐热性同样重要，因为耐热性的强弱直接决定了该害虫的分布南界和夏季的种群动态。然而，有关西花蓟马耐热性的研究还未见报道。6本研究的立题依据及意义西花蓟马起源于北美，至今已扩散至全世界多个国家，并造成了严重的经济损失。在我国，该虫于1998年在昆明被首次报道，随后于2003年在北京爆发成灾(张友军等，2003)。截止到2010年，该害虫已经入侵至多个地区，大有向我国南北两端继续扩张的趋势(郑长英等，2007；吴青君等，2007；袁成明等，2008；严丹侃等，2010；刘佳等，2010；杨华等，2010)。由此产生的了两个问题，首先是西花蓟马为什么能在如此短的时间内能入侵全国大部分地区?已有的研究表明，这可能与西花蓟马自身较强的繁殖能力和抗药性的产生有关。此外，温度也是一个不容忽视的因素，因为西花蓟马对温度耐受性的强弱直接决定了它的分布范围。有关西花蓟马耐寒性的研究已有一些初步报道，但我国的气候条件更为复杂，因而不同种群的西花蓟马可能在耐寒性方面可能存在差异。而有关西花蓟马的耐热性至今还未见报道。其次，西花蓟马入侵的内在机理是什么?最近的研究表明外来生物之所以能够迅速入侵，是因为入侵种往往具有很强的环境适应能力。入侵种能迅速合成和表达一系列的抗逆蛋白，从而抵御环境的胁迫(Lockwoodeta1．，2010；ZerebeekiandSorte，2011)。然 20扬州大学博士学位论文而，这样的研究也未见报道。因此，弄清西花蓟马中国种群对温度的耐受性及其调控机制对深入理解该害虫的入侵机制具有重要意义；同时，也为该害虫的科学管理提供理论支持。7研究内容为了回答以上问题，本研究主要包括以下内容：1低温胁迫对西花蓟马存活及生殖的影响(论文第二章)该部分内容主要是为了明确西花蓟马对低温的耐受范围、快速冷驯化的诱导、增强耐寒性的维持以及快速冷驯化的生态学代价。2高温胁迫对西花蓟马存活及生殖的影响(论文第三章)该部分内容主要是了解西花蓟马在不同高温区和高温处理时间下，种群对热胁迫的耐受存活能力、快速的热驯化对耐热性调节能力的影响以及高温胁迫对生殖的影响，从而阐明该虫各虫态对高温胁迫下的致死敏感高温区，热耐受性获得的环境诱导效果和适合度代价。3西花蓟马5个Hsps基因的克隆机序列分析(论文第四章)该部分的内容主要包括利用RT-PCP渤RACE技术，克隆西花蓟马5个Hsps基因的全长序列和基因组序列，并对所获得㈣0进行结构特征，基因组结构比较及进化等方面的生物信息学分析，为阐明其在西花蓟马抵御温度胁迫过程中的作用奠定基础。4西花蓟马5个Hsps基因的表达模式(论文第五章)为阐明西花蓟马5个Hsps在温度胁迫过程中的作用，采用Real．timePCR检测了它们在西花蓟马的不同发育阶段、不同温度胁迫及热驯化条件下各基因的表达模式。5温度和阿维菌素对西花蓟马生物学参数、抗氧化酶活力及Hsps表达的影响((论文第六章)此部分内容主要了解温度和西花蓟马的双重胁迫对西花蓟马存活、寿命、产卵量，5个抗氧化酶和Hsps的影响，从生态、生理和分子水平阐明温度升高和阿维菌素对西花蓟马的联合作用 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扬州大学博士学位论文．^．I●．--J一刖吾第二章低温胁迫对西花蓟马存活及生殖的影响西花蓟马隶属缨翅目、蓟马科，又名苜蓿蓟马，是一种危害蔬菜和观赏植物的重要害虫。西花蓟马除直接取食寄主造成危害外，还能传播番茄斑萎病毒等多种病毒(Mound，1996；Vaileta1．，1996；飚rk，2002；陆亮等，2009)，而且传播毒病造成的经济损失常常大于其直接危害。西花蓟马源产于北美，由于其广泛的寄主范围和很强的生殖繁育能力，加之世界各国之间频繁的贸易往来，目前己扩散至许多国家和地区，包括欧洲，非洲，亚洲，澳洲，并在这些地区造成了巨大的经济损失(KirkandTerry，2003；MorseandHoddle，2005)。在我国，该虫于2003年在北京首次发现，并爆发成灾(张友军等，2003)；此后，在云南、浙江、山东、贵阳、江苏等地相继报道该虫的危害，并有进一步扩散的态势(郑长英等，2007；吴青君等，2007；袁成明等，2008)。在中国，西花蓟马每年可以发生几代到十几代不等。一般于春末开始在田间活动，6．7月达到种群的高峰期，然后随着温度降低种群数量开始锐减。在我国南方地区，该虫可以全年发生；而在北方地区该虫主要以成虫或若虫在保护地越冬(Okazakieta1．，2007；Oroszeta1．，2009)。此外，已有的研究表明，该虫在不具备滞育特性(Ishidaeta1．，2003)。对昆虫而言，温度是最为重要的非生物环境因子。每个物种都具有各自适宜的温度范围，超出此范围对其生理和代谢过程极为不利。因此，昆虫对极端温度的耐受范围决定了它的种群动态和地理分布(景小红，2004)。低温对西花蓟马存活的影响已有一些报道(McDonaldeta1．，1997；Tsumukieta1．，2004)。然而，昆虫对温度的耐受性可能因发育阶段(Jenseneta1．，2007；Terblancheeta1．，2007；Maraiseta1．，2009)，性别(Sarenseneta1．，2007)和地里种群(YoshinoriandYukio1999；Kimura,2004)的不同而存在明显差异。自西花蓟马入侵我国以来，已有学者运用各种软件对其潜在适生区进行预测(杜予州等，2005；程俊峰等，2006如2006b)，但这些预测往往不能全面反映该虫的实际分布范围。因此，开展西花蓟马耐寒性研究，可以为该虫的分布北界以及制定科学的防控措施提供依据。本研究主要探索以下三个问题：(1)西花蓟马对低温的耐受范围和不同性别，不同发育阶段的西花蓟马对低温的耐受性是否存在差异；(2)西花蓟马是否具有快速冷驯化的能力，这对西花蓟马在低温环境下的存活十分关键；(3)快速冷驯化对西花蓟马对种群适合度的影响，探讨西花蓟马在耐寒性增强的同时是否是以其种群适合度的下降为代价。 李鸿波：入侵害虫西花蓟马对温度胁迫的响应1材料与方法1．1供试虫源西花蓟马种群于2008年9月取自浙江省农业科学院，在室内用四季豆豆荚进行多代饲养后备用。室内饲养在RXZ型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)中进行，温度为26土1oC，湿度为70．80％，光暗比为16：8。实验中所用若虫为2龄若虫，而成虫为24h内羽化的成虫。1．2实验方法1．2．1西花蓟马成虫和若虫的耐寒性测定将若虫和24h内羽化的西花蓟马成虫置于玻璃管内，用200目纱布封口防止其逃逸，同时保证空气流通，然后将玻璃管放入一塑料盒中，置于盛有酒精的低温恒温槽内暴露2h，暴露低温范围为-8至．14oC(每个间隔为1oC)，平均降温速率为O．1．0．2oC／min。将处理过的西花蓟马置于26oC的人工气候箱中，2h后用小毛笔轻轻刺激虫体，如不能正常活动，认为死亡。每个处理30头虫，重复4次。1．2．2快速冷驯化对西花蓟马存活率的影响设5oC和OoC为驯化温度。实验时，将西花蓟马成虫和若虫置于驯化温度下处理2h，然后再将驯化后的若虫和成虫分别暴露在．13oC和．13．5oC下处理2h，以不经过驯化直接暴露在．13oC和．13．5oC下处理的为对照。将处理后的西花蓟马置于26oC下，2h后观察其死亡情况。每个处理30头虫，重复4次。1．2．3快速冷驯化的持续性检测为了探明经快速冷驯化增强的耐寒性是否具有持续性，将经O℃驯化2h的西花蓟马置于26oC下恢复O、O．5、1、1．5、2h，然后将其置于识别温度下2h。处理结束后，将西花蓟马置于26"C下恢复，2h后检查存活情况。每个处理30头虫，重复4次1．2．4西花蓟马快速冷驯化的生态学代价许多研究表明快速冷驯化能提高昆虫在低温下的存活率，但是以其种群适合度为代价的，为了探讨快速冷驯化对西花蓟马种群适合度的影响，设置以下几个处理：(1)对照组(Contr01)：饲养在26。C下；(2)快速冷驯化组(rapidcoldhardening，RCH)·0。C下处理2h；(3)快速冷驯化与暴露组(RCH+exposed，RE)-0oC下驯化2h，然后暴露于识 扬州大学博士学位论文别温度下2h；(4)直接暴露组(direrectlyexposed，DE)：直接暴露于识别温度下2h。将处理后的西花蓟马转入26oC下，2h后取其存活的蓟马若虫继续饲养，观察其发育情况。待其羽化为成虫后，取成虫5对(雌：雄=1：1)置于放有新鲜无虫豆叶的玻璃瓶中让其产卵，叶片每天更换1次，直到成虫全部死亡。更换出来的叶片置于含有湿润滤纸的培养皿中，并用保鲜膜封口，用昆虫针在保鲜膜上扎40．50个小孔以保证通风。此后每天观察成虫的产卵情和存活情况。由于蓟马的卵产于植物组织里，因此以孵出的若虫数量为西花蓟马的有效产量。以上各处理重复4次。1．3数据分析采用ANOVA(S)法进行数据差异显著性分析，然后利用Tukey法对各处理进行多重比较。利用限制性方程估计Ltem50，即在特定时间下导致50％个体死亡的温度。以上部分数据分析前进行反正弦转换，统计过程在软件DPS或SPSS中完成，显著性水平取0．05(TangandFeng，2002；SPSS．Inc．，2003)．。2结果与分析2．1西花蓟马成虫和若虫的耐寒性Three．WayANOVA分析表明暴露温度，暴露时间和性别对西花蓟马成虫的存活率具有显著影响(暴露温度：F=233．02，df=6，P<0．001；暴露时间：，=94．72，df=3，尸
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