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《介孔氧化铁材料快速_高效富集分离磷酸化肽段和蛋白的新方法研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、第36卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第7期2008年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry885～889介孔氧化铁材料快速、高效富集分离磷酸化肽段和蛋白的新方法研究3单喆韩路于锡娟屠波赵东元杨芃原(复旦大学化学系,上海200433)3-摘要以0.1μmol/Lβ2casein磷酸化蛋白酶解液为对象,利用在酸性条件下对PO4能够特异性吸附的氧化铁材料为新载体,对介孔氧化铁材料富集分离磷酸化肽段的孵育液酸含量、孵育液有机溶剂含量和洗脱液选择的条件进行了优化,结果表明:室温条件下,在含有0.1%乙酸和30%乙腈的孵育液中孵育5min后,经1mol
2、/LNH3·H2O溶液的洗脱,介孔氧化铁可有效地将磷酸化肽段从蛋白酶解液中富集分离。本方法也可以选择性地提取α2casein磷酸化蛋白,实现了简单、快速、高效的磷酸化肽段和蛋白的富集分离。同时,通过MALDI2TOF串级质谱分析,成功地完成了在优化条件下分离出的磷酸化肽段磷酸位点的鉴定。关键词基质辅助激光解吸飞行时间质谱,介孔氧化铁,磷酸化肽段,磷酸化蛋白,快速富集分离1引言[1～4]磷酸化修饰是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一,是目前蛋白组学研究的一个重要内容。由于磷酸化蛋白在生物体内的含量很低,在用MALDI2TOF2MS分析磷酸肽时,磷酸肽的信号容易[5,6]被其它高丰度的非磷酸
3、化肽段所抑制。因此,必须对磷酸化蛋白经酶解或降解后所得多肽混合物[7～10]中磷酸化肽进行有效地富集分离。目前,一些磷酸化肽段富集分离方法和技术已有报道,其中最广泛采用的技术是固定金属亲和色谱法(IMAC)。但该方法操作复杂,需要经过多步的活化、冲洗、洗脱过程,费时费力。因此,寻求新的简便、高效的磷酸化肽段富集分离方法十分重要。[11]3-Horanyi等发现,在酸性条件下,Fe2O3材料表面对PO4具有很强的特异性吸附,这一特性使得氧化铁可能作为富集分离磷酸化肽段和蛋白的候选载体,但有关此研究尚未见报道。本研究利用介孔氧化铁微球富集分离磷酸化肽段和蛋白,通过对实验条件的优化,经MALDI
4、2TOFMS鉴定证明取得了理想的富集分离效果。与传统Fe(Ⅲ)2IMAC相比,使用介孔氧化铁的富集分离过程中,消除了反复活化载体、冲洗非磷酸化肽段的步骤,是一种简单、快速、高效分离磷酸化肽段和蛋白的方法。2实验部分2.1仪器与试剂AppliedBiosystems4700ProteomicsAnalyzer(MALDI2TOF2MS,ABI公司);FeCl3·6H2O、NaOH、尿素、甲醛(分析纯试剂);牛β2酪蛋白(β2casein)、牛α2酪蛋白(α2casein)、胰蛋白酶(trypsin,非测序级)、CHCA(Cyano242hydroxycinnamicacid)、马心肌血红蛋白
5、(myoglobin)(Sigma公司);乙腈(ACN)、乙酸、三氟乙酸(TFA)(HPLC级,Merck公司);超纯水由Millipore纯水系统(Millipore公司)制备。2.2实验方法[12]2.2.1介孔氧化铁微球材料的合成取饱和FeCl3溶液和饱和NaOH溶液各20mL,分别加热至60℃,在强烈搅拌下,将NaOH溶液缓慢加入FeCl3溶液中,恒温搅拌10min制得棕红色的Fe(OH)3溶胶。将所得溶胶冷却到13℃,然后依次加入3.6g尿素(60mmol)和3.6mL甲醛溶液(43mmol,36%),搅拌30s后,静置2h。析出的棕黄色沉淀经过滤、水洗、乙醇清洗及干燥便制得了尿
6、醛树脂/Fe(OH)3复合微球。将所制得的复合微球缓[12]慢升温至550℃焙烧除去有机物即得到介孔氧化铁微球。经扫描电镜和氮气吸附/脱附表征,测得2007209224收稿;2007212203接受本文系国家自然科学基金资助项目(Nos.20505004、20405003、20405005、30530040)3E2mail:pyyang@fudan.edu.cn886分析化学第36卷介孔径氧化铁微球的平均粒径为3μm,表面介孔孔径约为48nm。2.2.2蛋白酶解取1.0mg牛β2酪蛋白(β2casein)溶于1.0mL50mmol/LNH4HCO3缓冲液中,加入25μg胰蛋白酶(tryps
7、in),在37℃下,酶解18h,用超纯水将蛋白酶解液稀释至0.1μmol/L,放入-20℃冰箱,冷冻待用。2.2.3磷酸化肽段蛋白富集、分离将2.5μL氧化铁悬浮液(5mg/mL)分别加入到200μL含有30%乙腈和0.1%乙酸的酶解肽稀释液(孵育液)中,室温下孵育5min,在10000r/min的条件下,离心沉淀氧化铁颗粒,吸走上层液;在氧化铁沉淀中加入20μLNH3·H2O溶液(1mol/L),震荡使无机颗粒重新分散
