胶原肽改善绝经后骨质疏松及雌激素诱导绝经后乳腺癌机制研究.pdf

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1、分类号：R151.41密级：公开学校代码：11065学号：2014010041学术博士学位论文胶原肽改善绝经后骨质疏松及雌激素诱导绝经后乳腺癌机制研究作者姓名刘峰指导教师王春波教授学科营养与食品卫生学培养单位医学部公共卫生学院答辩日期2018年5月15日胶原肽改善绝经后骨质疏松及雌激素诱导绝经后乳腺癌机制研究摘要目的：复制大鼠去卵巢致骨质疏松病理模型，研究胶原肽对绝经后骨质疏松改善作用及经时特点；筛选并建立过氧化氢（hydrogenperoxide,H2O2）诱导Saos-2细胞损伤病理模型，从氧化应激的角度，分析CP经FBXW7（F-boxandWDrepea

2、tdomaincontaining7）-p100-NF-κB（nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedBcells）通路保护成骨细胞的分子机制；分析绝经后乳腺癌妇女雌激素水平与REV7表达的相关性，从REV7诱导乳腺癌细胞上皮间充质转化的角度，探究雌激素诱导绝经后乳腺癌的机制。方法：1.CP改善大鼠去卵巢致骨质疏松的作用：选健康8周龄SD雌性大鼠100只，实验方案：正常组（SHAM）、模型组(OVX)、预防组(CP-P，1g/kg/d)、高浓度肽组（CP-H,1g/kg/d）和低浓度肽组（CP-L,0.

3、5g/kg/d）。适应性喂养1周后，仅预防组开始给予CP灌胃。在大鼠12周龄时，除正常组行假手术外，余组均行双侧卵巢摘除术。分别在0W(术后6W)、6W、13W、17W四个时间点，对大鼠股骨X线摄相仪经时摄片，以Image-ProPlus6.0软件分析右侧股骨平均灰度值；骨组织切片HE染色后，分别通过ImageJ和PhotoshopCS6软件分析骨组织形态计量学参数[骨小梁面积（trabeculararea，Tb.Ar）、骨组织面积（tissuearea，T.Ar）、骨小梁周长（trabecularperimeter，Tb.Pm）、骨体积分数（relativeb

4、onevolume,BV/TV,）、骨小梁数量（trabecularnumber,Tb.N）、骨小梁间距（trabecularseparation,Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecularthickness,Tb.Th）和骨皮质相对厚度（bonecorticalrelativethickness）的经时变化；免疫组织化学法检测转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）表达；腹主动脉取血，分离血清，Elisa法同期检测骨碱性磷酸酶（bonealkalinephosphatase,BALP）、I型原胶原氨基端前肽（pr

5、ocollagentypeIN-terminalpropeptide，PINP）、I型胶原交联羧基端肽（C-terminaltelopeptideoftypeIcollagen,CTX-I）和酒石酸碱性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP）水平；酶化学法分别测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）水平。12.CP经FBXW7-p100-NF-κB通路对H2O2诱导的Saos-2氧化损伤的保护作用：以人源成骨细胞系Saos-2为研究对象，M

6、TT法筛选H2O2诱导Saos-2细胞损伤的时间和浓度，同法分析确定CP的实验浓度，建立氧化损伤细胞模型。分别以MTT法检测细胞活性；酶化学法测定细胞内MDA水平和总SOD活性；分光光度法测定细胞内总活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）；Elisa法检测碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性。实验设计：正常组、H2O2组（300μmol/L）、阳性对照组（H2O2+NAC1mM）、H2O2+CP(200、400、800μg/mL)组、H2O2+CP(800μg/mL)+shp100组、H2O2+CP(800μg/

7、mL)+FBXW7组、H2O2+CP(800μg/mL)+shNF-κB组，H2O2+CP(800μg/mL)+FBXW7+shNF-κB组。通过qRT-PCR和Westernblot检测H2O2诱导的Saos-2细胞中FBXW7、p100和NF-κB（nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedBcells）mRNA和蛋白水平的表达情况及CP对其的影响。质粒转染技术和RNA干扰技术构建稳定过表达FBXW7及瞬时干扰的shp100或shNF-κB的Saos-2细胞系。应用上述构建成功的转染细胞系，同法观察细

8、胞活性、ALP活性和RO