受体相互作用蛋白激酶1抑制剂Necrostatin-1对小鼠急性肺损伤的治疗作用及分子机制研究.pdf

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1、分类号：R722密级：公开学校代码：11065学号：Y0114130039专业博士学位论文受体相互作用蛋白激酶1抑制剂Necrostatin-1对小鼠急性肺损伤的治疗作用及分子机制研究作者姓名管恩芹指导教师姜红教授专业领域儿科学培养单位医学部儿科学系答辩日期2018年5月13日1受体相互作用蛋白激酶1抑制剂Necrostatin-1对小鼠急性肺损伤的治疗作用及分子机制研究摘要目的：本研究通过脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导建立小鼠急性肺损伤（AcuteLungInjury,AL

2、I）模型，探索受体相互作用蛋白（Receptor-interactprotein，RIP）家族成员在ALI模型中的作用，并对急性肺损伤小鼠给予RIP-1抑制剂Necrostatin-1干预治疗。通过检测小鼠肺组织组病理学改变、肺灌洗液中相关炎症因子的表达、髓过氧化物酶(MPO)活性，以及肺组织RIP激酶家族的表达、体内生存期的变化、necrostatin-1在组织及体外细胞水平的信号通路、炎症反应的作用，探讨急性肺损伤的发病机制，以及RIP-1抑制剂Necrostatin-1作为潜在急性肺损伤治疗策略的

3、可行性。材料和方法：1.ALI模型的建立选取12只8周龄BALB/c雄性小鼠为研究对象，随机分为对照组和ALI（脂多糖诱导ALI）组，每组各6只。ALI组通过尾静脉注射脂多糖（LPS，10mg/kg）诱导ALI，对照组通过尾静脉注射相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。两组小鼠均在造模后24h，断颈处死小鼠，剥离小鼠肺组织，组织病理学染色（H&E）检测小鼠肺组织病理；利用酶联免疫吸附实验（ELISA）评估肺灌洗液和血液中炎症相关因子白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-8、IL-1

4、β、环氧合酶-2（COX-2）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达情况，以此来评价ALI模型的建立效果。2.利用蛋白质印迹（Westernblot）和免疫组织化学（IHC）染色测定对照组和ALI组的小鼠肺组织中RIP激酶家族（RIP-1，RIP-2和RIP-3）的表达水平。3．necrostatin-1体内实验将18只8周龄的BALB/c雄性小鼠随机分为对照组、ALI（LPS+DMSO）组、necrostatin-1组，每组6只。ALI组和necrostatin-1组小鼠行LPS诱导AL（I方法同1

5、ALI组），对照组为正常对照组（方法同1对照组）。necrostatin-1组在LPS经尾静脉注射建模的同时，腹腔注射特异性RIP-1抑制剂necrostatin-1（10mg/kg）;ALI组在LPS经尾静脉注射建模的同时，腹腔注射二甲基亚砜（DMSO），作为necrostatin-1治疗组对照。观察各组小鼠生存时间，以及肺组织的组织病理学变化。在necrostatin-1和二甲基亚砜腹腔注射24小时后，断颈处死小鼠，剥离小鼠肺组织、收集肺灌洗液，然后分别利用组织病理学技术和免疫组织化学染色技术检测小

6、鼠肺组织形态和RIP-1表达情况；利用Westernblot检测小鼠肺组织中RIP-1的表达情况和下游靶标NF-κB信号通路蛋白的表达情况；利用ELISA检测肺灌洗液和血液中炎症相关I因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表达情况；测定小鼠肺组织中髓过氧化物酶（MPO）活性。4.细胞水平的研究将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分为对照组、DMSO+LPS组、necrostatin-1+LPS三组。其中，DMSO+LPS组和necrostatin-1+LPS组中，经LPS

7、处理后，分别利用溶剂对照DMSO和necrostatin-1进行处理。然后收集小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞总蛋白和细胞培养上清，利用westernblot检测细胞中RIP-1和IKKα（inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinase-α），NF-κBp50和NF-κBp65蛋白的表达；利用ELISA检测细胞培养上清中炎症相关因子IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1的表达情况。结果：1.LPS诱导的肺损伤模型的建立和鉴定病理学H&E染色镜检发现

8、，ALI组与对照组相比，注射LPS的ALI组小鼠中出现典型的肺损伤现象，肺泡结构大面积破坏，广泛的肺水肿，肺泡间隔增厚，肺泡严重出血，肺泡塌陷，以及明显的炎症细胞浸润，肺损伤评分升高（p<0.05）。ELISA检测炎症因子发现，ALI组与对照组相比，ALI组的肺灌洗液（BALF）和肺组织中IL-6、TNF-α、IL-8、IL-1β、COX-2、MCP-1表达水平显著高于对照组（p<0.05）。2.LPS诱导的肺损伤对RIP家族蛋白的影响We