TRAIL基因多态性与椎间盘退行性变易感性机制的研究.pdf

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1、分类号：R681.5密级：公开学校代码：11065学号：Y0114130072专业博士学位论文TRAIL基因多态性与椎间盘退行性变易感性机制的研究作者姓名徐世民指导教师李书忠教授专业领域外科学（骨外）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月18日TRAIL基因多态性与椎间盘退行性变易感性机制的研究摘要目的：运用多聚酶链式反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）及基因测序的方法，检测IDD患者TRAIL基因1525和1595两个位点的多态性。在基因水平上分析TRAIL基因多态性与椎间盘退行性变疾病易感性之间

2、的关系，以及TRAIL基因多态性与椎间盘退行性变程度的相互关系。通过ELISA方法对椎间盘退变患者的TRAIL血清浓度进行检测，分析TRAIL基因表达与椎间盘退变相关性，以及其与椎间盘退变分级之间的关系。为了进一步验证过表达TRAIL促进IDD发生，我们采用siRNA的方法降低人髓核细胞中TRAIL基因的表达，然后采用H2O2处理髓核细胞，检测细胞的凋亡以及凋亡相关基因表达的变化，探讨TRAIL基因过表达与髓核细胞氧化损伤之间的关系。为椎间盘退行性变疾病的诊断、预防、治疗和判断预后提供依据。方法：1.选取360例潍

3、坊市人民医院脊柱外科2014年12月-2016年12月之间确诊的腰椎间盘退行性变疾病的患者作为实验组。本研究已预先通过潍坊市人民医院伦理委员会批准并书面同意，所有研究对象均签署知情同意书。实验组男性186例，女性174例，年龄在31-71岁之间（平均年龄为56岁）。其中174例患者为腰椎间盘突出症、75例患者为腰椎管狭窄症、111例患者为腰椎退行性脊柱侧凸。按照Schneiderman分级方法对实验组进行分级，其中Schneiderman分级II级117例，III级120例，IV级123例。对照组为在体检期间招募的

4、120名健康个体。对照组男性54例，女性66例，年龄在32-72岁之间（平均年龄52岁）。2.采集所有研究对象血液样本，提取血细胞中的基因组DNA，登录GenBank查阅获得TRAIL基因序列，设计TRAIL基因上下游引物，PCR对基因进行扩增。采用PCR-RFLP法鉴定TRAIL基因多态性患者，取10µLPCR产物，特异性内切酶酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，筛选出可以多态的样本。基因测序的方法进一步鉴定患者TRAIL基因多态性。ELISA法检测研究对象血清TRAIL蛋白的表达。分析TRAIL基因表达

5、与椎间盘退行性变的易感性关系。同时对实验组和对照组TRAIL基因1525和1595位点的基因型频率及等位基因频率等指标进行比较，分析其与实验组影像学分级之间的关系。3.采用TRIzol试剂提取椎间盘中总RNA，柱式血液RNAout提取总RNA，并I对提取总RNA逆转录为cDNA，根据TRAILmRNA序列设计的引物，qPCR检测样本中TRAILmRNA的丰度。取出椎间盘部分组织，液氮研磨成粉末，加入组织裂解液，提取椎间盘组织中的蛋白质，对提出的蛋白质进行定量之后，Westernblot印迹的方法检测组织中TRAIL

6、蛋白的表达。观察TRAILmRNA和蛋白质在1525AA、1525GA、1525GG基因型患者和1595TT、1595CT、1595CC基因型患者中的差异，分析1525位点和1595位点的多态性与TRAIL基因异常表达之间的相关性。4.将髓核细胞接种于96孔板中，37℃培养24h，在培养孔中加入50μmol/L的H2O2，细胞生长曲线法测定髓核细胞生长速度。在培养孔中分别加入0、50、100、200、300、400μmol/L的H2O2，诱导髓核细胞氧化损伤，流式细胞术检测髓核细胞凋亡。免疫荧光法检测髓核细胞中TR

7、AIL蛋白的水平。荧光定量PCR和Westernblot的方法检测细胞中TRAIL基因的表达情况，Westernblot的方法检测Caspase-2、Caspase-9以及Bcl-2等凋亡相关基因的表达。5.化学合成干扰TRAIL基因的dsRNA，采用脂质体转染方法将干扰dsRNA瞬时转染至人髓核细胞HNPC内，荧光定量PCR和Westernblot的方法检测髓核细胞中TRAILmRNA和蛋白的表达。为观察TRAIL在髓核氧化损伤中发挥的作用，实验在干扰TRAIL基因的HNPC中加入H2O2，诱导髓核细胞氧化损伤，

8、流式细胞术检测髓核细胞凋亡，Westernblot检测TRAIL基因的表达，以及Caspase-2、Caspase-9以及Bcl-2等凋亡相关基因的表达。结果：1.Schneiderman分级法，所有的椎间盘退行性变疾病患者进行分级：I级，椎间盘信号无损失；II级，中度椎间盘信号损失；III级，椎间盘严重的信号损失；IV级，椎间盘的信号完全损失。结果表明，分