库尔勒香梨SPL及其启动子克隆和对低温的应答反应.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015201303单位代码：10759石河子大学硕士学位论文库尔勒香梨SPL及其启动子克隆和对低温的应答反应学位申请人王玉凯指导教师牛建新教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称园艺学研究方向果树学所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年6月SPLanditspromotercloningandresponsetolowtemperatureofkorlafragrantpearADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegr

2、eeofMasterofAgricultureByWangYuKai(Biotechnologyoffruittrees)DissertationSupervisor:Prof.NiuJianxinJune,2018摘要目的：在库尔勒香梨生产实践中发现，花期遭遇低温可大幅增加脱萼果的比例，但其机制尚不清楚，前期的研究结果初步表明，kfpSPL有可能参与萼片的发育和调控。因此，克隆kfpSPL基因的DNA及其启动子序列，预测其作用元件和功能，并检测花期低温对其表达的影响，可为阐明花期低温有利于萼片的脱落分子机理奠定一定基础。方法：以库尔勒香梨花器官为材料，于盛花期（全树50%花朵

3、开放），采集标记‘库尔勒香梨’树的全花（花梗以上部分）30个，去除花瓣并从萼片和子房交界处分割成两部分。（1）根据已经得到的库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因组信息设计引物。以库尔勒香梨基因组DNA序列为模板进行kfpSPL基因组DNA序列的扩增。用kfpSPL基因cDNA全长序列与梨基因组数据库进行比对，获得上游启动子参考序列。利用参考序列设计引物，以库尔勒香梨基因组DNA为模板经PCR扩增获得库尔勒香梨kfpSPL基因上游启动子序列。（2）根据所获得的库尔勒香梨kfpSPL基因的全长为模板，利用primer5.0设计实时荧光定量PCR引物，提取库尔勒香梨总RN

4、A使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒RN09（Aidlab）。总RNA中的基因组DNA去除使用DNaseI,RNase-free(1U/μL)，总RNA反转录使用PrimeScriptTMRTreagentKit(PerfectRealTime)(TaKaRa，Japan)。以各个样品提取的cDNA为模板，用CFXmanager(Bio-RadUSA)实时定量PCR仪进行kfpSPL基因的实时定量PCR分析。（3）利用Illumina测序技术和生物信息学手段对4℃低温处理下的库尔勒香梨花器官进行差异基因的筛选和功能注释。结果：（1）从库尔勒香梨基因组DNA中扩增得到长

5、度为3320bp的kfpSPL基因组DNA。从库尔勒香梨基因组DNA中克隆得到上游启动子序列，经测序表明启动子长为2332bp，通过生物信息学分析启动子序列，预测顺式作用元件及其功能。（2）相比较于24小时4℃处理，12小时4℃冷处理可以较为有效的提高kfpSPL基因在库尔勒香梨初花期的相对表达量。相比较于其他两个时长的处理，喷施冷水后6小时采样的处理可有效的提高kfpSPL基因在库尔勒香梨初花期的相对表达量。（3）通过Illumina高通量测序建立了库尔勒香梨花器官在4℃低温处理条件下8小时处理样品和24小时处理样品及其二者对照样品的数据，经过数据拼接得到了96662条Uni

6、genes，并对其在7大数据库中进行功能注释，其中67769条Unigenes在7大数据库中获得了功能注释。样品经测序后共获得转录本序列154020条。结论：本试验通过PCR技术获得了库尔勒香梨的基因组DNA及其上游启动子调控序列，对其二序列进行了生物信息学分析，得到了翻译起始密码子，并分析预测了启动子序列的顺式调控元件及功能。通过实时荧光定量PCR对低温处理条件下的库尔勒香梨花器官中的kfpSPL基因表达量进行检测，通过数据分析得到使基因表达量提高的处理时长。通过Illumina高通量测序，筛选获得了低温处理条件下的库尔勒香梨花器官中的差异表达基因，并在7大数据库中进行了功能

7、注释。关键词：库尔勒香梨；SPL基因；启动子；调控元件；生物信息学分析；实时荧光定量PCR；Illumina高通量测序AbstractObjective：Itwasfoundintheproductionpracticeofkorlapear,thelowtemperatureofthefloweringperiodcansignificantlyincreasetheratioofcalyx,butthemechanismisunclear,Preliminaryresearchresul