FlaA对单核细胞增生李斯特菌LM90SB2毒力及生物被膜形成的影响研究.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015201720单位代码：10759石河子大学硕士学位论文FlaA对单核细胞增生李斯特菌LM90SB2毒力及生物被膜形成的影响研究学位申请人孔静雅指导教师周霞教授马勋教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月EffectofFlaAproteinonvirulenceandbiofilmformationofListeriamonocytogenesLM90SB2.ADissertationS

2、ubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByJing-yaKong(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.Zhouxia,MaxunJune,2018摘要单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是一种胞内寄生的革兰氏阳性致病菌，能够引起动物和人类的脑膜炎、流产、败血

3、症等疾病，死亡率能够达到20%-30%，对人类及畜牧业的生产有着重要的危害。研究证实众多的毒力因子与LM的毒力有关，其中鞭毛不仅能介导LM的运动，还在LM对细胞的黏附、侵入和繁殖过程中发挥着重要作用。作者所在实验室从发生“转圈病”的绵羊大脑中分离到1株LM，命名为LM90SB2并进行了大量相关研究，但编码鞭毛亚基的flaA基因对LM90SB2毒力及生物被膜（BF）形成的影响还未见详细报道。本研究通过利用同源重组技术构建LM90SB2的flaA基因缺失株，通过测定缺失株LM90SB2-ΔflaA的小鼠LD50测

4、定、细胞的黏附和侵染能力以及BF的形成等的影响，分析FlaA在LM90SB2感染过程中的作用。主要研究内容及结果如下：1.LM90SB2的flaA基因缺失株的构建及其稳定性遗传本实验采用重叠PCR（SOE-PCR）方法得到融合片段ΔflaA，将其与pMD19-T连接后，经过酶切再与酶切后的穿梭质粒pKSV7连接得到pKSV7-ΔflaA，将重组质粒pKSV7-ΔflaA电转化进至LM90SB2感受态细胞中，在氯霉素与温度的压力下进行同源重组。经过30代基因重组获得双交换基因缺失株后，转入无抗性培养基最终获得无

5、抗性的基因缺失株。试验成功构建出具有良好遗传稳定性的LM90SB2的flaA基因缺失株，并命名为LM90SB2-ΔflaA。2.LM90SB2-ΔflaA运动能力的测定及对小鼠毒力（LD50）的影响研究采用半固体琼脂法测定细菌的运动性、菌落计数法计算小鼠脏器载菌量、改良寇氏法计算小鼠LD50。与野毒株相比，LM90SB2-ΔflaA的晕圈直径由1.38cm下降到0.50cm，运动能力下降了63.77%；与野毒株相比LM90SB2-ΔflaA在感染小鼠肝脏中的载菌量降低，差异显著（p<0.05），脾脏与肾脏中的

6、载菌量虽有所降低，但差异并不显著（p>0.05）；与野毒株相比，LM90SB2-ΔflaA的LD6750值从4.27×10cfu上升到了1.62×10cfu，致病能力下降了3.8倍。结果表明FlaA显著影响LM90SB2的运动性和毒力。3.LM90SB2-ΔflaA黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7细胞的能力分析将MBMEC细胞和RAW264.7细胞培养成单层，分别按5:1和10:1的比例接种细菌。以LM90SB2为对照，分别于细菌黏附MBMEC细胞、RAW264.7细胞1h裂解细胞，通过倍比稀释涂板进行

7、菌落计数；细菌分别侵染上述细胞2h后裂解细胞倍比稀释涂板后进行菌落计数。结果显示LM90SB2-ΔflaA对MBMEC细胞的黏附数（1.6×104cfu）低于LM90SB2的黏附数（2.8×104cfu），差异显著（p<0.05）；侵袭数（5.8×102cfu）低于LM90SB22（6.5×10cfu），但差异并不显著（p>0.05）。LM90SB2-ΔflaA对RAW264.7细胞的黏附数（5.0×105cfu）和侵袭数（2.3×105cfu）均低于LM90SB2（8.9×105cfu和3.3×105cfu

8、），差异显著（p<0.05）。试验表明FlaA能影响LM90SB2对细胞黏附和侵袭能力。4.FlaA对LM90SB2生物被膜形成能力的影响将LM90SB2与LM90SB2-ΔflaA培养于96孔细胞培养板，分别于2、6、10、12、24、48h时用结晶紫染色，荧光倒置显微镜下观察BF形成情况；采用乙醇-丙酮混合液溶解BF，测定OD595定I量测定BF的形成量；在含有盖玻片的6孔细胞培养板中培养细菌，