嗜碱盐单胞菌菌株X3的氮代谢相关功能基因的研究.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150110176上海海洋大学硕士学位论文题目：嗜碱盐单胞菌菌株X3的氮代谢相关功能基因的研究Studyontherelatedfunctionalgenes英文题目：ofnitrogenmetabolisminHalomonasalkaliphilaX3专业：生物学研究方向：微生物生态姓名：王越指导教师：李秋芬研究员二O一八年五月七日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注温海深中国海洋大学教授主席李成林山东省海洋生物研究所研究员委员宋志文青岛理工大学教授委员中国水产科学研究院黄海水柳学周研究员

2、委员产研究所中国水产科学研究院黄海水曲克明研究员委员产研究所中国水产科学研究院黄海水朱建新研究员委员产研究所中国水产科学研究院黄海水助理研究丁东生秘书产研究所员中国水产科学研究院黄海水2018年5月22日答辩地点答辩日期产研究所4号楼4楼会议室下午上海海洋大学硕士学位论文嗜碱盐单胞菌菌株X3的氮代谢相关功能基因的研究摘要随着我国城镇化步伐的加快、工农业和养殖业的大规模发展，含有高浓度氮的废水排放量不断增加，造成大量氮素渗入地表和地下径流，而产生水体富营养化等问题，严重威胁着生态环境的平衡。在废水脱氮工艺中，生物脱氮较传统的物化法脱氮技术具有经济高效，操

3、作简单，且不容易对环境造成二次污染的优势。本实验室前期分离纯化得到一株具备高效脱氮功能的细菌嗜碱盐单胞菌(Halomonasalkaliphila)X3，研究X3菌株的氮代谢相关机理，对日后该菌株在废水脱氮中的高效应用和探究该类菌在海洋氮循环中的地位都具有重要意义，本文通过酶活检测、PCR、qRT-PCR检测等方法，对HalomonasalkaliphilaX3氮代谢途径及相关酶的存在和功能进行了验证，并利用多种软件对各基因编码的相应蛋白质的二级结构、3D结构和系统发育等进行了分析，主要结果如下：（1）通过PCR反应，验证全基因组测序预测到的nasA和

4、narGYVJ的存在，未扩增到没有预测到AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor相关功能基因的片段，同时培养过程中，未检测到硝化反应的关键中间产物羟胺和反硝化反应产生的气体，因此初步判断HalomonasalkaliphilaX3的氮代谢途径中不存在编码AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor等各种酶的功能基因，可能不存在硝化和反硝化路径，其对无机氮的利用是通过硝酸盐的异化和同化反应途径实现的，即分别在异化型硝酸盐还原酶Nar和同化型硝酸盐还原酶NasA的催化作用下，将硝酸盐转化生成亚硝酸盐，再转化成氨氮，再合成细胞物质的。（2）Halom

5、onasalkaliphilaX3氮代谢通路中存在异化型硝酸盐还原酶Nar，且具有表达活性。该酶催化硝酸盐转化到亚硝酸盐的反应，且酶活性为每克蛋白21.415U。HalomonasalkaliphilaX3中的Nar由α、β、γ和δ四个亚基构成，分别由为narG、narY、narV和narJ编码。基因簇narGYJV编码的蛋白功能区域中1-1246氨基酸属于NarG超家族，构成Nar的α亚基；1261-1752氨基酸属于DMSOR-beta-like超家族，构成Nar的β亚基，2061-2279氨基酸构成γ亚基，1802-2018氨基酸构成δ亚基。Na

6、rG、NarY和NarV的3D结构与PDB中大肠杆菌的1Q16模型的3D结构最接近，覆盖率达96-100%。系统发育树显示X3菌株中NarG在同菌属中遗传距离较近，与坎帕尼亚盐单胞菌(HalomonasI上海海洋大学硕士学位论文campaniensis)和盐单胞菌属(Halomonassp.)WN018的一致性最高，高达99%；NarG在不同菌属间虽然功能相似，但同源性较低。NarY与大肠埃希菌(Escherichiacoli)中的氨基酸序列的同源关系较近，证明异化型硝酸盐还原酶Nar中不同亚基的演化方向和系统发育地位均不同。（3）Halomonasa

7、lkaliphilaX3中存在同化型硝酸盐还原酶NasA；经拼接获得了其功能基因nasA全长为2739bp的全序列；发现该基因具有表达活性，且其在好氧条件下的表达量高于厌氧条件下的；预测到HalomonasalkaliphilaX3的NasA中存在固氮酶中都含有的Mo元素，且NasA中未预测到信号肽，证明其是胞内酶；NasA的氨基酸中13-587氨基酸属于Molybdopterin-binding超家族；594-712氨基酸属于MopB_CT超家族；847-896氨基酸属于NirB超家族。通过系统发育树分析，X3菌株的nasA基因与Halomonasc

8、ampaniensis和Halomonassp.TD01的同源性最高，nasA基因在不同的菌属