notch1调控神经母细胞瘤tet21n细胞增殖及mycn转录以及残留神经母细胞瘤细胞对预后判断的意义

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1、Notchl调控神经母细胞瘤Tet21N细胞增殖及MYCN转录以及残留神经母细胞瘤细胞对预后判断的意义姓名：蔡娇阳指导教师：汤静燕教授专业：儿科学研究方向：儿童白血病与肿瘤临床与基础研究申请学位级别：博士培养单位：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心论文提交时间：2013．04NOTCHlREGULATESNEURoBLASToMATET21NCELLGROWTHANDMYCNTRANSCRIPTIONANDDETECTIoNOFMINIMALRESIDUALDISEASEISAPRoGNoSTICMA

2、RKERFoRNEUROBLASToMAPhD．Candidate：JiaoyangCaiSupervisor：ProfessorJingyanTangSubject：PediatricsResearchAspect：PediatricLeukemia／OncologyApplydegreelevel：PhD．Institute：ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，ShanghaiChildren’SMedicalCenterSubmitdate：2013

3、．．04上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：扩日期：州'年)月乙日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论

4、文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于f不保刈。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：之g白≮(日期：力I笋丫月力日日期：>of，年厂月少日摘要目的探讨RNA干扰技术沉默Notchl基因对人神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)Tet21N细胞增殖和MYCN转录的影响；阐明骨髓微量残留病灶(minimalresidual

5、disease，MRD)检测方法及其结果对高危神经母细胞瘤患儿预后的影响。方法1、以神经母细胞瘤细胞株Tet21N为细胞模型，利用该细胞为强力霉素调控MYCN表达细胞，即仅在缺乏强力霉素或四环素的情况下表达MYCN，利用pGIPZ慢病毒载体的shRNA干扰Notchl信号途径，通过CCK8法测定细胞增殖、BrdU标记法细胞周期测定，研究Notchl沉默的Tet21N细胞增殖及细胞周期的改变；通过染色质免疫共沉淀一实时荧光定量PCR法研究Notchl沉默对MYCN转录的影响。2、应用CD45．FITC／CD

6、81．PE／CD56一PECy5单抗组合通过流式细胞术(flowc”ometⅨFCM)检测了人神经母细胞瘤细胞株TGW的免疫表型并确定本实验室FCM检测MRD的敏感度为1×10‘4；对57例Ⅳ期骨髓浸润神经母细胞瘤患儿治疗前及化疗4个疗程后骨髓标本进行FCM检钡iJCD45一／CD81+／CD56+细胞阳性率，并分析MRD检测的临床预后价值。结果1、利用pGIPZ慢病毒载体I拘1)kNotchlshRNA干扰神经母细胞瘤细胞株Tet21N的Notchl信号途径建立稳定的Notchl沉默的Tet21N细胞系

7、，由实时荧光定量PCR及WesternBlot技术在mRNA和蛋白水平证实，从而获得可分析Notchl沉默的神经母细胞瘤Tet21N细胞模型。2、通过CCK8法细胞增殖检测发现Notchl—Tet21N细胞较Notchl+Tet21N增殖快。通过BrdU标记法细胞周期测定发现Notchl一MYCN+细胞较NotchI+MYCN+Tet21N细胞S期比率高(300／60VS．16．3％)；Notchl一MYCN一细胞较Notchl+MYCN—Tet21N细胞S期细胞比率高(1．98％vs．10％)。3、通过

8、染色质免疫共沉淀一实时荧光定量PCR法对MYCN启动子及其下游基因进行检测，结果提示Notchl沉默使Tet21N细胞MYCN转录下调。4、比较了57例初诊时FCM检测骨髓MRD阳性患儿平均化疗4个疗程后MRD结果与预后关系，57例患)L5年无事件生存率为22．4％，平均生存时间34．6个月(7"--69月，95％CI27．8---41．3)。化疗4个疗程后30例患儿MRD转阴，其中10例复发(33．3％)，随访时间45．5个