资源描述：
《red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2008,28(12):89~93*Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展1,22**张雪温廷益(1天津科技大学生物工程学院天津3004572中国科学院微生物研究所北京100101)摘要Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换。与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点。分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam3种蛋白质的功能,Red重组系统运用于大肠杆菌基因敲除的3种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯
2、糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件。关键词Red重组大肠杆菌基因敲除同源臂L-阿拉伯糖中图分类号Q819同源重组作为体内基因工程的新方法使DNA修的末端,从5向3降解DNA单链,产生3末端单链悬[3]饰变得更容易、更有效,它是功能基因组分析的高效方突(3single_strandDNAoverhangs)[Carter等法,可以在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情况下(1971)]。Beta作为单链退火蛋白,结合在由核酸外切[1]实现DNA修饰。酶(Exo)外切产生的3末端单链悬突上,促进D
3、NA互传统同源重组方法是利用RecA重组系统,但是以补链的退火[4~6]。Gam蛋白作为Exo、Beta的辅助蛋RecA同源重组为基础的基因敲除有很大的不足,如需白,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制RecBCD核酸要较长的靶基因同源臂,重组率很低,很难获得所需要[7]外切酶活性,抑制体内的外源DNA的降解。的重组子等。RecBCD是高度ATP依赖的双链DNA核酸外切[2]1998年,Murphy首次报道了利用噬菌体Red酶,在大肠杆菌中用于基因的同源重组和DNA复制叉重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换的方法,的修复。研究表明,Gam蛋白对于反应进行中的将噬菌体的重
4、组功能基因exo,bet,gam在多拷贝质RecBCD双链DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事实粒上表达,用于野生型E.coli宿主菌的基因替换。近上,Gam蛋白并不能抑制一个正在进行的反应,而是在年来,Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等[8]ATP的存在下分离连在双链DNA末端的RecBCD。优点广泛用于大肠杆菌的基因修饰中。Red重组系统在大肠杆菌等一系列基因工程菌的2Red同源重组相关质粒的介绍基因修饰中发挥了重大的作用。本文将从Red重组的Red重组系统共需要3种质粒:一种质粒是同源重作用机理,相关质粒,技术方法及国内外研究应用等方组辅助质粒,其提供协助同源重组
5、的exo、bet、gam3个面进行讨论。基因,用于表达重组系统的3个蛋白;另一种质粒含有1Red同源重组的作用机理两侧带有翻转酶结合位点(flipaserecognitiontarge,tFRT)的抗性基因,用作PCR模板;最后一种质粒为抗Red同源重组由噬菌体的exo,bet,gam3个基因组成,分别编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质。性基因消除质粒,其含有重组酶,用于消除染色体上同Exo作为双链核酸外切酶,可以结合在双链DNA源重组的抗性基因。本文将介绍几种最常用的相关质粒。收稿日期:20080625修回日期:20080822*国家863计划(2006
6、AA02Z216)资助项目2.1同源重组辅助性质粒pKD46、pRedET**通讯作者,电子信箱:wenty@im.ac.cnpKD46含有温度敏感型的复制起点oriR101,在90中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l28No.12200830培养时可以正常复制,而高于37时会自动丢失。pRedET含有oriR101温度敏感型复制子,在30在pKD46上还含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam复制。带有受pBAD启动子调控噬菌体的red,,基因,它们通过L阿拉伯糖诱导表达,并携带氨苄青霉3个基因,通过L阿拉伯糖诱导表达。pB
7、AD同时受素抗性基因作为筛选标记(图1)。araC基因产物的正调控和负调控,araC作为转录阻遏物可以与L阿拉伯糖形成复合物,从而启动转录。2.2提供抗性片段的质粒pKD3/pKD4pKD3含有氯霉素抗性基因,且在抗性基因两侧有FRT位点,常在Red重组系统中作为抗性标记使用。pKD4作用机理与pKD3相同,抗性标记不同于pKD3的氯霉素,为卡那霉素抗性(图2)。2.3抗性基因消除质粒pCP20pCP20含有温度敏感型
