羊肚菌多酚氧化酶性质的研究

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1、万方数据万方数据6620眠坳f．26，ⅣD．6良品雨量噶譬※基础研究1．2．4酶促反应的初速度范围Ⅲ操作方法：以0．4m1酶样+1．0ml不同浓度的底物+1．6m1纯净水为反应系统，按1．2．3所述的方法测定底物浓度不同时的反应速度。以邻苯二酚溶液为底物的浓度(mol，L)设计为：O．001、0．005、0．01、0．05、O．1、0．5、1．0。1．2．5酶浓度【E】对酶促反应速率的影响【z】操作方法：由1．2．4确定了初速度范围的底物浓度【S】，在此基础上固定底物浓度，只改变酶浓度【E】，操作方法同上。【E】通过加入体积控制，加入体积(

2、u1)分别为：50、100、150、200、250、300、400、600。[E】+[S】+纯净水总体积为3m1。1．2．6以邻苯二酚为底物的MEPPO动力学2l研究采用双倒数作图法：l／V=Km，v⋯×1／[S】+l／V一。【S】的范围控制在O．33～2．0K。，在酶促反应初速度范围内，固定所加酶液的量，改变所加底物邻苯二酚的量，然后测定酶的活力，再绘制双倒数(LineweaverBurk)图，确定K。和V。。，以确定以邻苯二酚为底物的MEPPO动力学公式。1．2．7pH值对MEPPO活力的影响【2】pH值设计为：2、3、4、5、6、7、

3、8、9、10、11、12。操作方法：不同pH值调节液2．6ml+200ul酶液+200u11m01／L邻苯二酚，测A420，1min／次，共5min，以确定pH对MEPPO活力的影响。1．2．8温度对MEPPO活力的影响【2l温度(℃)设计为：0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、1OO。操作方法：在5ml塑料管中加入上述反应系统，然后在不同的设定温度下反应15min，立即取出于100℃沸水浴中灭活5min，再倒入1cm比色皿中测A·：o，确定酶反应最适温度。1．2．9温度对MEPPO稳定性的影响【2】操作方法：各取酶液

4、1．4IIll于1．5ml离心管中分别在30、40、⋯、70℃保温，然后分别保温O、2、4、6、8、10h后取出200u1于1cm比色皿中，再加入200ul1mol／L邻苯二酚和2．6ml纯水组成反应系统，测A。zo，1次／min，共10min。2结果与讨论2．1酶促反应的初速度范围试验结果见表l。舍；耄g菇巷邻苯二酚浓度(m01，I，)圄1底物浓度[s]对酶促反应初速度的影响Fig．1E什ectIonofsubst陋teconcentration【S】oninitiaIVeIocityof旧actiOnpmmOtedbyMEPPO由图1可

5、以看出MEPPO在底物浓度为0～0．01mol／L时呈线性变化，即可认为该底物浓度范围为MEPP0的初速度范围。在MEPPO浓度很低时，反应速度与底物浓度无关，反应速度直到底物消耗殆尽时还保持不变，为零级反应；当MEPPO浓度足够大时，反应速度随底物浓度的增加而呈线性增加，为一级反应：dv／dt=K[S]。反应的级次视条件而定，反应速度不是简单地服从一级、二级或零级反应的规律；一个反应在一定时间内遵循着一种级次，随后则又产生偏差。就底物浓度的变化讲，许多酶反应是近于一级的⋯。2．2酶促反应速率随【E】的变化试验结果见表2。由图2可以得出：在

6、酶催化反应体系中，当加酶量在200ul／m1范围以下时，反应速度与加酶量呈线性关系，即MEPPO酶促反应为一级反应。而且此变化趋势万方数据※基础研究食品雨量垮篁2005．Vbl．26．No．667表4pH对MEPP0活力的影响1-abIe4EffectiOnofpHOnactiVityOfMEPPO；耋鬻着怄酶液浓度(u∞IⅡ1)图2酶促反应初速度随[E】变化F．g_2EffectjonofMEPPOconcent阳tiononinitialvelocityof怕actiOnpromotedbyMEPPo很明显，即酶浓度的增大也影响酶促反应

7、速度的增大。在一定条件下，酶的浓度与反应速度成正比。因为酶催化反应时，酶先要与底物形成一中间物。当底物浓度大大超过酶浓度时，反应速度达到最大速度。这时增加酶的浓度可增加反应速度，反应速度与酶浓度成正比关系⋯。2．3以邻苯二酚为底物的MEPPO动力学试验设计及结果见表3。表3MEPPO动力学试验设计及结果1．abIe3Exper．mentdesignandresultOnMEPPOKinetics从图3可以得出：双倒数图在横坐标轴上的截距一1，K。=一170，即K。=0．00588，K。是当酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。又直线在纵坐

8、标轴上的截距l／V。。=50，故V。。=0．02。不同酶促反应的K。可相差很大，1／K。值可用来表示对底物的亲和力，K。表示底物和酶亲和力弱，酶与底物亲和力大，则1，K。大、即K