虫生真菌分子生物学研究进展

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1、·88·微生物学通报2001年28(3)X虫生真菌分子生物学研究进展王成树李增智(安徽农业大学经济昆虫菌物研究所合肥230036)摘要:虫生真菌分子生物学的研究自开展以来,有20多种与杀虫毒力相关的蛋白酶得到纯化,而与之相对应的基因也分别得到克隆、测序。陆续的基因克隆表明,虫生具菌中的重要毒力基因以基因族的形式存在,在精确的表达调控下以适应不同的寄主种类和不同的环境条件。基因工程研究表明,以增加毒力基因拷贝的方式可显著提高虫生真菌的杀虫速率,带有外源基因标记的菌株也是环境释放示综研究的良好材料及方法。关键词:虫生真菌,蛋白酶,基因

2、克隆,表达调控,基因工程中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:025322654(2001)0320088205近年来,由于虫生真菌在害虫持续控制及维护物种多样性方面的特殊优势,其应[1]用及基础研究发展迅速。商品化方面曾经有40余种产品登记注册,其中研究及应用比较成熟的主要为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumaniso2pliae)、蜡蚧轮枝孢(Verticilliumlecanii)、玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)及汤普生被毛孢(Hirs

3、utellathompsonii)等。随着分子生物学技术及水平的迅速发展,虫生真菌的分子生物学研究方面也不甘落后,目前已经纯化的蛋白酶类约20余种,其相应基因种类也相继得到克隆测序(表1),主要是与毒力相关的因子,其中研究比较[2]成熟的是金龟子绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶类及其相关基因,现在马里兰大学StLeger研究组正进行金龟子绿僵菌的基因组测序,随着对cDNA序列功能分析的不断进行,将有大量的基因被陆续报道。这些研究的目的是为了解决虫生真菌杀虫速率缓慢的弱点,以期从分子生物学水平上提高菌株的杀虫毒力,在最大程度及范围上发挥虫生真

4、菌在害虫控制上的优势及潜力。1蛋白酶纯化目前所分离、纯化的酶类主要是虫生真菌入侵昆虫体壁过程中所产生的蛋白酶类,因而在不同程度上表现与菌株毒力相关。StLeger由巨大蜚蠊(Blaverusgigantesu)体壁离体诱导试验表明,金龟子绿僵菌孢子萌发过程至少有42种蛋白产生,其中主要为酸性蛋白酶类(pI412～516),这些酶类一般均由结构不同的同工酶组成为一个酶系,如金龟子绿僵菌PR1A及PR1B理化特性相近,但氨基酸序列只有53%的同源性;PR2已[3,4]知的2个同工酶的同源性为56%。另外就酶活性而言,PR2、PR4、T

5、RY1也可认为X国家自然科学基金资助项目(No.39870013)ProjectGrantedbyChineseNationalNaturalScienceFund(No.39870013)收稿日期:2000203208,修回日期:20012012202001年28(3)微生物学通报·89·属于同一类同工酶系。几丁质酶系又可分为几丁质内切酶系(分子量为33kD、42kD、2816kD)和外切酶系(66kD)两大类,Kang等分离的60kD几丁质酶既具内切酶活性又[5]具外切酶活性,金龟子绿僵菌中至少存在10种不同的几丁质同工酶。显

6、而易见的是由于氨基酸序列不同,编码这些酶的基因也不尽相同,pr1A及pr1B还位于不同的染[4]色体上。新近克隆的金龟子绿僵菌胰凝乳蛋白酶只表现出与放线菌灰色链酶菌[6](Streptomycesgriseus)类蛋白55%的同源性。2基因克隆利用不断改进的克隆技术,各类生物模式种的遗传密码正逐步得到诠释,虫生真菌中约有20余种基因被克隆测序(表1)。研究表明虫生真菌中的毒力基因多以基因簇(genecluster)的形式存在,如金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因(pr1)已经克隆[2,4]的有pr1A、pr1B...pr1I(Ge

7、nBank注册号AJ251925,AJ289823,AJ400706,AJ251967,AJ251964,AJ251965,AJ251972,AJ293220);金龟子绿僵菌几丁质酶基因[5](chit)至少存在10种不同类型;已克隆的球孢白僵菌pr1与bsn1也同属于类枯草杆[7,8]菌蛋白酶基因。这些基因族可以位于不同的染色体上,如金龟子绿僵菌的pr1A、[4]pr1B。丝状真菌染色体或其片段具有丢失的现象,球孢白僵菌的染色体也表现出长度和数量上的多样性,虫生真菌这种进化上的适应避免了因重要基因丢失而死亡的可能。金龟子绿僵菌p

8、r1A经克隆测序的cDNA序列与其在基因组中的序列相比较发现存[2]在3个内含子,分别为68、56及72bp。序列比较发现球孢白僵菌pr1中也有3个内[8]含子,大小分别为72、61及68。两者pr1中所有内含子5’2GTA(C)AG,3’2TAG