东北对开蕨孢子体诱导技术的研究_王阳

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1、北方园艺２０１４（１９）：９３～９８·生物技术·东北对开蕨孢子体诱导技术的研究王阳，董然，顾德峰，刘美彤（吉林农业大学园艺学院，吉林长春１３０１１８）摘要：以东北对开蕨孢子为试材，采用无菌培养及常规繁殖的方法，研究了常规条件和无菌条件对孢子体诱导的影响。结果表明：孢子最佳萌发培养基为１／４ＭＳ无糖培养基；最佳增殖培养基为ＭＳ＋１５ｇ／Ｌ蔗糖；最佳孢子体无菌诱导培养基为ＭＳ培养基；最适宜的常规诱导条件是以草炭为最适宜基质，温度２０～３０℃，空气湿度９５％。关键词：东北对开蕨；孢子体诱导；孢子繁殖中图分类号：Ｓ６８２．３５文献标识码：Ａ文章编号：１００１－０００９（２０１

2、４）１９－００９３－０６东北对开蕨（ＰｈｙｌｌｉｔｉｓｊａｐｏｎｉｃａＫｏｍ．）属铁角蕨科粉溶液。在超净工作台上将叶片顺着孢子囊群生长方（Ａｓｐｌｅｎｉａｃｅａｅ）对开蕨属（Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ）林下多年生常绿草本向切成１ｃｍ×１ｃｍ带孢子囊的小片，用含有吐温－２０的［１］植物，又称日本对开蕨、对开蕨，在中国仅一属一种。０．１％ＨｇＣｌ２溶液浸泡４ｍｉｎ灭菌，灭菌后用无菌水冲洗它的自然分布范围十分狭窄，仅少量分布于长白山南麓６～８次，使用无菌滤纸吸干表面分后准备接种。［２］和西部局部地区，对生境要求严格，由于近年来环境１．２试验方法破坏严重且人为野外大量采挖，导致其自然

3、储存量逐年１．２．１孢子的萌发以ＭＳ为基本培养基，设置ＭＳ、减少，已经濒临灭绝，是世界稀有物种，属于我国国家二１／２ＭＳ、１／４ＭＳ３个处理，分别设置０、１５、３０ｇ／Ｌ３个蔗级珍稀濒危保护植物。糖浓度水平，共９个处理，ｐＨ５．８，琼脂浓度７．０ｇ／Ｌ，经近年来，国内外学者就东北对开蕨已开展细胞学、过１２１℃高压蒸汽灭菌锅灭菌２０ｍｉｎ后分装至５０ｍＬ［３－１８］繁殖栽培及生理等方面的研究。该试验应用保存于三角瓶中。每瓶接种１片带孢子囊小叶片（图１），每个吉林农业大学苗圃基地内的东北对开蕨组培苗，进行孢处理２０瓶，３次重复。培养条件为温度（２５±２）℃，光照子无菌培养

4、，研究其常规转化和无菌转化的技术，以期强度１０００～１５００ｌｘ，光周期１２ｈ／ｄ。为东北对开蕨的资源保护和进一步开发利用提供技术支持。１材料与方法１．１试验材料供试东北对开蕨（ＰｈｙｌｌｉｔｉｓｊａｐｏｎｉｃａＫｏｍ．）孢子采自吉林农业大学苗圃基地内。选取栽培３～４ａ长势健壮良好的东北对开蕨组培苗，挑选叶片背面孢子囊群成熟且已经变为褐色的叶片，整片剪下，置于洁净的硫酸纸袋中，在４℃冰箱内密封保存备用。取东北对开蕨带孢子囊叶片整片，先用蒸馏水浸泡３０ｍｉｎ，再用脱脂棉占取饱和洗衣粉溶液擦洗叶片，要避免触及孢子囊，然后用蒸馏水再次擦去叶片表面的洗衣图１孢子无菌接种时的状

5、态Ｆｉｇ．１Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆｓｐｏｒｅ第一作者简介：王阳（１９８９－），女，硕士研究生，研究方向为野生植１．２．２原叶体的增殖在１．２．１的基础上，进行原叶体物引种驯化。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｎｇ０６０８＠ｑｑ．ｃｏｍ．的继代增殖。切取约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ原叶体团，每瓶接责任作者：董然（１９６６－），女，吉林长春人，博士，教授，现主要从事种１０团，每个处理５瓶，３次重复。采用ＭＳ为基本培野生植物引种驯化等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｒ９９９＠１６３．ｃｏｍ．养基，ｐＨ５．８，琼脂７．０ｇ／Ｌ。设置ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、基金项目：国家

6、“十二五”科技支撑计划资助项目（２０１２ＢＡＤ２２Ｂ０４０１）；吉林省科技发展计划资助项目（２０１１０２６２）。Ｎ６４个处理，分别设置０、１５、３０、６０ｇ／Ｌ４个蔗糖浓度水收稿日期：２０１４－０６－１０平，９０ｄ后将原叶体取出称重，记录每瓶的总鲜重后，设９３·生物技术·北方园艺２０１４（１９）：９３～９８置６０℃恒温烘干６ｈ，记录每瓶总干重。每天观察各处１．２．４孢子体的无菌转化无机盐浓度与蔗糖浓度的理中原叶体的发育情况。自第１片孢子体转化成功开配比：以ＭＳ为基本培养基，设置ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、Ｎ６始，３０ｄ后进行数据分析。４个处理，分别设置０、１５、３０

7、ｇ／Ｌ３个蔗糖浓度，共１２个１．２．３孢子体的常规转化基质的筛选：设腐殖土、草处理，ｐＨ５．８，琼脂７．０ｇ／Ｌ。每瓶３０片原叶体，每个处炭、园土、河沙和混合基质（草炭∶腐殖土＝１∶１）５种基理１０瓶，３次重复。培养条件为（２５±２）℃，光照强度质，基质分别过２４目筛，１２１℃高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ，置１０００～１５００ｌｘ，光周期为１２ｈ／ｄ，自第１片孢子体转化于口径１２ｃｍ的塑料花盆中，底部垫少量泡沫防止积水，成功开始，３０ｄ后进行数据分析。生长调节剂的配比：放入约２／３基质后压实整平，整盆浸水直至基质表面湿将增殖后的原叶体分成２０片左右的小块，