烟草黄瓜花叶病毒一步法rt-pcr检测试剂盒的研制与初步应用

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1、万方数据烟草科技／TobaccoScience＆Technology病虫害防治／Disease&PestControl2011年第lO期(总第291期)烟草黄瓜花叶病毒一步法RT．PCR检测试剂盒的研制与初步应用张俊祺1，刘相兵2，罗朝鹏1。杨军“，宋纪真1，尹启生1，宋浩21．中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号4500012．湖南中烟工业有限责任公司，长沙市劳动中路426号410007关键词：黄瓜花叶病毒；RT-PCR；检测试剂盒；特异性；稳定性；灵敏度摘要：为快速准确地检测烟草黄瓜花叶病毒(CMV)，

2、根据黄瓜花叶病毒基因组序列相对保守区域设计了一对特异性引物，整合了反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件的优化，建立了基于一步法RT-PCR检测烟叶感染CMV的方法，在此基础上组装了检测试剂盒。进一步分析了该试剂盒的特异性、稳定性和检测灵敏度。结果表明，该试剂盒具有很强的特异性、良好的重复性和较高的灵敏度(模板RNA浓度最低达到10ng量级)。初步应用结果显示，在多个烟区采集的病叶样品检测结果均与ELISA检测结果一致，能够成功检测出cMV。中图分类号：s432．41文献标识码：A文章编号：1002—0861(2011)10

3、—0065—05DevelopmentandPreliminaryApplicationofOne·-stepRT··PCRKitforDetectionofTobaccoCMVZHANGJUN—Q1(1)，LIUXIANG—BING(2)，LUOZHAO-PENG(1)，YANGJUN(1)，SONGJI—ZHEN(I)，YINQI—SHENG(1)，andSONGHAO(2)1．ZhengzhouTobaccoResearchInstituteofCNTC，Zhengzhou450001，China2．ChinaTobaccoH

4、unanIndustrialCo．，Ltd．，Changsha410007，ChinaKeywords：Cucumbermosaicvirus(CMV)；RT—PCR；Detectionkit；Specificity；Stability；SensitivityAbstract：TodetecttobaccoCMVquicklyandaccurately，apairofspecificprimerswasdesignedaccordingtotherelativelyconservativeregionintheCMVgenomies

5、equence，andenzymesandbuffersneededforreversetranscriptionandPCRwereintegrated．Byoptimizingreactionconditions，amethodfordetectingCMV—infectedtobaccobasedonone—stepRT—PCRwasdevelopedandadetectionkitwasassembled．Thespecificity，stabilityandsensitivityofthekitwereanalyzed．T

6、heresultsshowedthatthekitfeaturedstrongspecificity，goodrepeatabilityandhighersensitivity．ThelowestRNAconcentrationoftemplatereached10ngmagnitudelevel．Thepreliminaryapplicationresultsindicatedthatthedetectionresultsofinfectedleavessampledfromseveralareasagreedwiththeres

7、ultsofELISAtest。thekitcoulddetectCMVsuccessfully．烟草病毒病是烟草生产中的主要病害之一，对烟基金项目：国家烟草专卖局科技项目、郑州烟草研究院科技项目“烟草主要病毒病分子变异监控及追踪技术研究”(122009CZ04lO)。作者简介：张俊祺(1988一)，在读硕士研究生，研究方向：食品科学与烟草农业。E—mail：junqi513@gmail．tom；‘通讯作者：杨军E·mail：yangjuntr@sohu．corn口收稿日期：201l一04一18责任编辑：董志坚E-mail：yckj

8、2256@yahoo．corn．cn电话：037l-67672650叶产量和品质造成重大影响¨⋯。烟草黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)在各烟区均有发生。从20世纪70年代以来，CMV保持着病毒病中优势种群