日本血吸虫三价dna疫苗pvivo2-sjfabpsj26.sjgapdh的构建及保护性免疫的研究

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1、http://www.paper.edu.cn日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及保护性免1疫的研究朱路，龙全科，陈家丽，鲁明波，余龙江*华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉（430074）E-mail：yulongjiang@hust.edu.cn摘要：目的构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH)，26kDa的谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗并鉴定，然后观察其在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作

2、用。方法根据Sj26和SjGAPDH序列合成两对特异性引物，通过重组PCR技术，将Sj26和SjGAPDH改造为Sj26.SjGAPDH融合基因。构建质粒pVIVO2-SjFABP,再将Sj26.SjGAPDH克隆入pVIVO2-SjFABP的MCS2，获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH；瞬时转染MCF-7细胞，通过RT-PCR检测抗原基因在mRNA水平的表达，验证质粒DNA的有效性；通过间接荧光免疫检测疫苗在小鼠体内抗原表达，并免疫小鼠进行免疫保护性效果试验评价。结果经过单酶切、双

3、酶切、四酶切及测序验证，该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.GAPDH构建成功；该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.57%。结论三价DNA疫苗具有比单价和双价DNA疫苗更加良好的免疫保护作用。关键词：日本血吸虫，脂肪酸结合蛋白，3-磷酸甘油醛脱氢酶，26kDa的谷胱甘肽S转移酶，三价DNA疫苗0.引言日本血吸虫病是一种严重的人畜共患的寄生虫病,在热带和亚热带地区是比较严重的公共卫生问题，流行于世界上74个国家和地区，全世界有近2亿人受到日本血吸虫病的感染，

4、[1]每年因为日本血吸虫病死亡的人数高达5万人。在中国，目前有152万人被日本血吸虫感[2]染，其中一半以上出现了临床症状。日本血吸虫疾病的防治方法主要依赖于灭螺和大规模化学疗法（采用的药物主要是吡喹酮、青蒿琥酯及蒿甲醚），化学疗法是目前控制血吸虫疾病的主要方法，但日本血吸虫病的诊断和治疗的费用昂贵，且治愈后容易反复感染，而反复[3]频繁地进行药物化疗容易造成虫体产生耐药性，因此，需要研究开发新的防治方法，疫苗[4]是目前公认的一种更为有效的防治日本血吸虫疾病的方法。日本血吸虫疫苗研究开发经历了死疫苗、减毒活疫苗

5、、基因工程疫苗和DNA疫苗4个阶段。DNA疫苗与前三种传统疫苗相比，具有安全、廉价、易保存和运输等优点，并能同时诱发体液免疫、Th细胞和CTL免疫应答，还可通过构建多价DNA疫苗增强其免疫保护力，这一技术正受到越来越广泛的关注。已有许多报道表明，多价DNA疫苗的免疫保护力[3][5]优于单价。为此，本实验室在研究开发单价、双价DNA疫苗的基础上，已经成功构建了pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH的三价DNA疫苗并大量制备，通过瞬时转染MCF-7细胞，以及RT-PCR检测抗原基因在mRNA水平的表达

6、，验证了质粒DNA的有效性。再通过间接荧光免疫检测疫苗在小鼠体内抗原表达，并观察该疫苗在小鼠体内诱导机体免疫保护的效果，探讨了血吸虫攻击感染时，三价DNA疫苗与单价、双价DNA疫苗免疫保护效果比较的优势，为研究开发三价DNA疫苗提供理论和实验依据。1本课题得到教育部博士点基金(No.20070487059)和国家863项目资助(No.2004AA2Z3212)的资助。-1-http://www.paper.edu.cn1.材料与方法1.1菌株及载体真核表达载体pVIVO2，E.coliDH5α超效感受态细胞，MC

7、F-7细胞系为本实验室保存。1.2主要试剂限制性内切酶PagI、XbaI、BamHI、EcoRI，T4DNAligase，Trizol试剂盒，DNA纯化、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、pGEM-T载体试剂盒、质粒DNA中量提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Promega公司；潮霉素B购自Roche公司；其他普通生化试剂均为国产的分析纯包装。1.3虫种及实验动物日本血吸虫成虫由湖北省疾病控制中心血吸虫防疫站馈赠；阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所；4周龄雄性BALB/C小鼠60只购自武汉生物制品研究所。1.4引物

8、设计与合成SjFABP基因的引物根据SjFABP编码序列(GenBank接受号：AF331756)设计：上游引物P1：5’-cgggatccgccaccatgtcttctttcttggga-3’，下游引物P2：5’-gcgaattcttacaatcgtttgtaattc-3’。Sj26的引物设计根据Sj26的编码序列(GenBank接受号：M14654)设计，上游引物P3